MicroRNA-145负向调控catenin-δ1抑制胃癌浸润的机制研究

发布时间：2020-08-20 23:27

【摘要】：研究背景：胃癌是危害人类健康的常见恶性肿瘤之一,随着生活方式和饮食习惯的改变,我国胃癌的发病率急剧上升。尽管近年来胃镜技术的发展使得胃癌的早期诊断率得以提高,手术方式和药物治疗的进步,使得早期胃癌患者的生存率大大改善,但进展期胃癌患者的预后仍然较差,死亡率仍居高不下。目前胃癌发生、发展机制尚不清楚,胃癌癌变过程是多阶段、多基因参与的复杂过程,寻找和鉴定胃癌相关标志物,探讨其在胃癌发生发展中的分子机制,为早期诊断和干预、治疗提供分子靶点,成为胃癌研究的重要内容,更为临床研究提供理论依据。我们前期在对N.cadherin(神经钙黏蛋白)与胃癌发展关系的研究中发现catenin家族的成员之一catenin.δ1(CTNND1)与cadherin家族成员的关系比较密切,两者结合形成的cadherin-catenin复合物在肿瘤发生和发展的过程中起着重要的作用。CTNND1主要是与E-cadherin(上皮粘附素)的跨膜结构域结合,定位于细胞膜的内侧,维持细胞极性的稳定。当E-cadherin缺失时,CTNND1大部分游离于细胞浆,浆定位的CTNND1连同N-cadherin结合一小部分CTNND1一起,一方面抑制RhoA(Ras homolog gene family,member A)GTPase的活性,另一方面激活Rac 1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1)和Cdc42(cell division cycle 42),共同促进迁移和浸润的发生,提示CTNND1可能为肿瘤相关基因。Castillo等在非小细胞肺癌的研究中发现CTNND1基因存在大量的扩增,而另有文献报道其在结肠癌和乳腺癌中的表达呈下调趋势,这说明CTNND1在不同肿瘤中的表达情况不同,提示其在不同肿瘤发生发展中的作用也可能不尽相同。Liu和Mann等研究还发现浆定位的CTNND1 与肺癌和胰腺癌的转移密切相关,提示CTNND1在促癌中的作用机制可能与其定位有关。目前CTNND1与胃癌关系的研究未见报道,胃癌中是否存在CTNND1的异常表达和定位的改变,以及CTNND1的表达和定位与胃癌发生和发展之间是否存在联系等问题仍有待于进一步探索。microRNA (miRNAs)是近年来发现的一种非编码的单链RNA分子,虽然其序列只有短短18-22个核苷酸,但其调控功能却异常强大。有研究表明,约650种人类niRNAs调控的靶基因占据了人类基因组的三分之一,且大多数信号转导通路都有miRNAs的参与,据报道超过50%的miRNAs被发现定位于与人类肿瘤相关的染色体上。miRNAs通过种子序列(其中的6-8个核苷酸),与靶基因的3’非编码区结合参与降解靶基因mRNA或抑制靶蛋白的翻译,从而参与调节人体的多种生理(包括细胞的生长、增殖、分化和凋亡等)和病理(肿瘤细胞的生长、增殖、浸润和转移等)过程。我们推测CTNND1也可能受到miRNA的调控,进而影响其生物学功能。通过检索Targetscan, PicTar, miRanda预测软件,我们发现CTNND1的3'-UTR区可以与miR-145, miR-197, miR-96, miR-143的种子序列匹配。通过荧光素酶实验的检测,我们发现miR-145转染组荧光活性下降最明显,提示CTNND1受miR-145调控的可能性较大。本研究中我们将进一步验证miR-145能否调控CTNND1的表达及其定位,研究CTNND1与cadherin家族成员的作用关系,并深入探讨其调控的分子机制。此外,我们还将构建裸鼠成瘤模型,在体内进一步验证CTNND1的表达及定位与胃癌浸润的关系。研究方法：1.本研究对126例临床胃癌标本和50例非肿瘤胃黏膜组织进行免疫组化方法检测CTNND1的表达和观察其细胞定位情况,并进一步分析其表达和定位与临床病理参数的关系。2.利用Kaplan-Meier方法绘制生存曲线,采用Log-rank检验对两组胃癌患者(阴性与阳性,膜定位与浆定位)的总体生存率和无瘤生存率进行统计分析,探讨CTNND1的表达及其定位与胃癌患者生存率的关系。3.通过Cox比例风险回归模型单因素和多因素统计分析,进一步验证CTNND1浆定位能否作为预测胃癌患者预后的独立危险因素。4.构建CTNND1过表达和siRNA质粒,将CTNND1 cDNA和CTNND1 siRNA质粒分别转染细胞,使CTNND1的表达上调和下调,然后验证其生物学功能。通过Transwell小室,MTS实验,流式细胞技术检测CTNND1的表达对细胞迁移和浸润能力、增殖和凋亡作用的影响。5.实时定量PCR检测胃癌组织中miR-145的表达情况,评估miR-145与总体CTNND1的阳性表达率是否存在相关性。同时扩增CTNND13 '-UTR区序列,构建pmirGLO荧光素酶载体,通过双荧光报告系统检测和western blot分析验证CTNND1是否受到miR-145的调控。6.对临床样本中miR-145与膜定位和浆定位的CTNND1的阳性表达率分别进行相关性分析,验证miR-145对CTNND1定位是否具有调节作用。转染miR-145和miR-control,通过细胞免疫荧光技术和western blot实验,观察CTNND1, E-cadherin 和 N-cadherin的表达及细胞定位的情况。进行N-cadherin siRNA转染,利用细胞免疫荧光技术和western blot实验探讨N-cadherin 在 miR-145调控CTNND1表达和定位中的作用,进一步阐明miR-145调控CTNND1浆定位抑制胃癌浸润的分子机制。7.将转染慢病毒表达载体pEZX-miR-145及pEZX-miR-control的肿瘤细胞注射到裸鼠体内,构建成瘤模型。6周后取出裸鼠中瘤体组织,测量两组裸鼠瘤体组织的直径,并对瘤体切片进行HE和CTNND1免疫组化染色,观察两组肿瘤组织浸润和CTNND1定位的情况,体内进一步验证CTNIMD1定位与胃癌浸润的关系。结果：1.免疫组化结果显示：在非肿瘤胃黏膜组织中,CTNND1定位于细胞膜。相比非肿瘤胃黏膜组织,CTNND1在胃癌组织中表达上调。CTNND1在胃癌组织中的表达有细胞膜和细胞浆两种定位形式,尤以浆定位居多。CTNND1的总体阳性表达只与胃癌的分化程度和Lauren分型相关,与其它临床病理参数无密切联系。而浆表达的CTNND与胃癌的临床分期、T分期、淋巴结和远处转移及Lauren分型情况密切相关。2. Kaplan-Meier生存曲线显示胃癌患者的总体生存时间和无瘤生存时间与CTNND1的定位密切有关,而与CTNND1的总体表达情况无关。CTNND1浆定位的肿瘤患者生存期更短,预后更差。3.通过Cox回归模型单因素统计分析,发现浆定位CTNND1, UICC临床分期,T分期,淋巴结转移和远处转移都是影响胃癌患者预后的危险因素。多因素统计分析表明浆定位CTNND1是预测胃癌患者预后的独立危险因素。4. CTNND1 cDNA质粒转染48h后与Mock control组相比,胃癌细胞SGC7901的迁移和浸润显著增加,同时CTNND1 siRNA转染后SGC7901的迁移和浸润能力又明显下降。MTS实验和流式细胞检测结果显示CTNND1的表达下调后对胃癌细胞的增殖和凋亡没有显著的作用。5.本研究结果显示miR-145的表达与CTNND1的阳性表达率存在负相关。荧光素酶实验结果发现miR-145 和 CTNND1-pmirGLO载体共转染组细胞的荧光强度明显低于对照组。转染miR-145后,western blot实验结果显示CTNND1蛋白表达明显下调。以上结果均提示CTNND1是miR-145调控的直接靶基因。6.相关性分析显示miR-145的表达与浆定位CTNND1的表达存在显著的负相关,提示miR-145可能参与了CTNND1定位的调节。细胞免疫荧光实验显示：miR-control转染组的细胞CTNND1主要定位于细胞浆,而miR-145转染组细胞CTNND1定位于细胞膜上。本研究进一步表明miR-145介导了CTNND1由细胞浆向细胞膜定位的改变。随后我们又检测了N-cadherin 和 E-cadherin的定位情况,发现与miR-control组相比,miR-145转染组细胞N-cadherin蛋白表达有所降低(荧光强度降低但定位没有改变),同时E-cadherin的定位也由细胞浆转变为细胞膜上。为进一步判断N-cadherin 在 CTNND1 和 E-cadherin的定位改变的作用,我们将N-cadherin siRNA转染的细胞进行免疫荧光实验,结果发现与对照组相比,N-cadherin siRNA转染组的细胞CTNND1口E-cadherin的表达也出现了膜定位的改变,这说明miR-145介导的CTNND1和E-cadherin定位的改变是通过N-cadherin的表达来实现的。Western blot结果显示转染miR-145 和 N-cadherin siRNA 后, CTNND1总蛋白表达下调,CTNND1膜蛋白表达却增加,而E-cadherin蛋白的表达量没有改变。7.动物实验结果表明pEZX-miR-145 及 pEZX-miR-control两组瘤体的大小没有显著差异。pEZX-miR-145组瘤体包膜完整,没有出现肌肉浸润的现象,免疫组化结果显示CTNND1主要定位于细胞膜。而pEZX-miR-control组瘤体包膜不完整,出现了肌肉和血管浸润的现象,其中CTNND1主要定位于细胞浆。Western blot检测结果显示pEZX-miR-145组CTNND1蛋白的表达明显低于pEZX-miR-control对照组。结论：1. CTNND1在胃癌组织中高表达,且主要定位于细胞浆。CTNND1的浆定位与胃癌的临床分期、T分期、淋巴结和远处转移及Lauren分型情况密切相关。2.相比CTNND1膜定位的胃癌患者,浆定位的胃癌患者生存时间更短,预后更差。浆定位CTNND1可以作为预测胃癌患者预后的独立影响因子。3.浆定位的CTNND1表达上调可以增强胃癌细胞迁移和浸润能力,但对细胞的增殖和凋亡无明显作用。CTNND1有望成为胃癌治疗的靶点。4. CTNND1的表达及定位受到miR-145的调控。CTNND1表达上调的原因在于miR-145表达的下调,CTNND1是miR-145的直接靶基因,miR-145不仅能下调浆定位CTNND1的表达,而且还可以介导CTNND1由细胞浆向细胞膜定位的改变。5.miR-145一方面可以通过直接下调CTNND1的浆表达发挥抑癌作用,另一方面又通过下调N-cadherin蛋白的表达间接恢复CTNND1和E-cadherin的膜定位,从而起到抑制胃癌浸润的作用。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.2

【参考文献】