LTBP4对恶性黑色素瘤细胞迁徙和侵袭影响的研究
发布时间：2020-08-21 18:45
【摘要】：[目的]1、应用RNAi技术抑制恶性黑色素瘤A375和A875细胞中LTBP4基因的表达,构建LTBP4沉默的恶性黑色素瘤细胞;2、通过CCK-8、Transwell、流式细胞术分别检测恶性黑色素细胞的增殖、迁移、侵袭及凋亡情况,探讨LTBP4对恶性黑色素瘤细胞迁移和侵袭能力的影响及其分子机制。[方法]1、LTBP4沉默的恶性黑色素瘤细胞系建立将恶性黑色素瘤细胞系A375和A875均分为3组,即实验转染组(siR-LTBP4)、阴性对照组(siR-NC)、空白对照组(Control)。实验转染组用 LTBP4特异性shRNA表达载体plvx-shRNA2-LTBP4经LipofectamineTM2000介导转染上述两种恶性黑色素瘤细胞系;阴性对照组用plvx-shRNA2-NC经LipofectamineTM2000介导转染两种细胞系;空白对照组的两组细胞系均未做任何处理。荧光显微镜下观察两株细胞的转染效率。运用荧光定量PCR和Western blot分别检测LTBP4基因的mRNA和蛋白表达水平,了解沉默效率。2、LTBP4沉默对恶性黑色素瘤细胞影响的检测采用第一部分构建的LTBP4沉默的恶性黑色素瘤细胞,通过CCK-8检测细胞的增殖情况;Transwell迁移实验检测细胞的迁移情况;Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭情况;流式细胞术检测细胞凋亡情况;探讨LTBP4对恶性黑色素瘤细胞迁移和侵袭能力的影响。3、LTBP4对TGF-β/BMP信号通路的影响沉默LTBP4后检测恶性黑色素瘤A375中TGF-β活性的变化,并通过Western blot检测了 LTBP4对不同形式TGF-β的影响。[结果]1、成功构建了LTBP4沉默的恶性黑色素瘤细胞系构建了LTBP4沉默质粒,并成功转染至两株恶性黑色素瘤细胞系中。荧光显微镜下,观测到转染效率达到80%以上。荧光定量PCR结果显示:进行扩增时,溶解曲线出现特异性峰,无非特异性扩增,获得的数据准确可靠。各样本采用2-△△Ct的相对表达量进行初步统计。荧光定量PCR结果显示,LTBP4的siRNA能够有效抑制LTBP4的mRNA表达水平,与control组或siR-NC组相比,差异具有显著性(P0.05)。而siR-NC组的LTBP4的mRNA表达水平同control组相比,无统计学差异(P0.05)。Western blot检测结果显示:siR-LTBP4能够有效抑制LTBP4在恶性黑色素瘤细胞系A375和A875中的表达水平,与control组和siR-NC组相比,差异具有显著性(P0.05)。Control组和siR-NC组相比,LTBP4的表达水平无统计学差异(P0.05)。2、LTBP4沉默后对恶性黑色素瘤细胞的影响CCK-8实验发现在24h和48h siR-LTBP4组的A875细胞和A375细胞均较siR-NC组和control组的增殖能力明显减弱,差异具有统计学意义(P0.05);siR-NC组与control组在24h和48h相比差异均无统计学意义(P0.05) ; A375和A875分别在不同时间,相同分组比较差异也具有明显统计学意义(P0.05)。Transwell迁移实验发现siR-LTBP4组迁移到Transwell小室下室面的A875细胞和A375细胞均较siR-NC组和control组明显减少,差异具有统计学意义(P0.05);siR-NC组与control组迁移细胞数相比差异均无统计学意义(P0.05)。Transwell侵袭实验发现siR-LTBP4组侵袭到Transwell小室下室面的A875细胞和A375细胞均较siR-NC组和control组明显减少,差异具有统计学意义(P0.05 );siR-NC组与control组侵袭细胞数相比差异均无统计学意义(P0.05)。流式细胞术检测结果显示,siR-LTBP4转染后能够明显升高恶性黑色素瘤细胞系A375和A875的凋亡率,同control组和siR-NC组相比,差异具有显著性(P0.05 )。Control组和siR-NC组相比较,在两个细胞中均无统计学差异(P0.05)。3、LTBP4沉默后可调控TGF-β/BMP信号通路LTBP4沉默后,细胞培养基中激活形式的TGF-β含量明显降低,而总TGF-β含量明显升高。Western blot检测结果发现TGF-β1的表达水平无明显变化,而TGF-β2和TGF-β3的蛋白表达水平显著增加。[结论]1、通过RNAi技术可有效抑制恶性黑色素瘤细胞A375和A875中LTBP4的表达,并使siR-LTBP4组的迁移、侵袭和增殖能力减弱,凋亡增强,LTBP4基因可能与恶性黑色素瘤的迁移、侵袭、增殖和凋亡有关。2、LTBP4沉默后恶性黑色素瘤细胞A375中TGF-β含量有明显变化,LTBP4可能参与调控TGF- β/BMP信号通路。3、LTBP4基因可能成为恶性黑色素瘤新的治疗靶点,为恶性黑色素瘤靶向治疗药物的开发提供一定的理论依据。
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R739.5
【图文】：
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本文编号：2799732
【学位授予单位】：昆明医科大学
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