肺癌相关间充质干细胞促进肺癌转移的机制研究

发布时间：2020-08-21 21:37

【摘要】：目的:本课题旨在研究肺癌组织来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)对肺癌细胞系生物学特征的影响,并初步探究肺癌相关MSCs促进肺癌转移的机制。方法:无菌条件下收集新鲜切除的肺癌患者瘤组织分离肺癌相关MSCs,并进行体外培养传代及鉴定。慢病毒感染建立稳定表达绿色荧光蛋白(CopGFP)的人肺腺癌细胞株A549和H1299。体外,Brdu法检测肺癌相关MSCs对A549和H1299增殖的影响;划痕实验检测肺癌相关MSCs对A549和H1299迁移能力的影响;Transwell法检测肺癌相关MSCs对A549和H1299侵袭能力的影响。体内,检测肺癌相关MSCs有无致瘤性;A549细胞按高、中、低三种细胞数进行裸鼠皮下接种,利用小动物活体成像技术观察肺癌相关MSCs对A549生长的影响;尾静脉注射A549细胞,利用小动物活体成像技术观察肺癌相关MSCs对A549转移能力的影响。qPCR和Western blotting检测A549与肺癌相关MSCs共培养后的A549细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关指标表达的变化;qPCR检测A549与肺癌相关MSCs共培养后A549细胞干性指标(CD133、CD44、NANOG、SOX2、OCT4)变化;ELISA法分别检测A549和肺癌相关MSCs基质金属蛋白酶MMP2的分泌水平,qPCR检测A549与肺癌相关MSCs共培养后的MMP2变化,从而初步探究肺癌相关MSCs促进肺癌转移的机制。结果:成功从肺癌患者瘤组织中分离并培养肺癌相关MSCs,经鉴定其具有多向分化潜能,且表面标志表达符合国际认定标准。经慢病毒感染成功建立稳定表达绿色荧光蛋白的人肺腺癌细胞株A549-CopGFP和H1299-CopGFP。体外,肺癌相关MSCs对肺癌细胞增殖无明显影响,但可明显提高肺癌细胞的迁移能力和侵袭能力。体内,肺癌相关MSCs不但能够促进肺癌细胞的生长,提高肺癌细胞在体内的成瘤率,还能促进肺癌细胞在体内转移。进一步研究发现,肺癌细胞与肿瘤相关MSCs共培养后,肺癌细胞EMT指标(转录因子Snail和Slug)在RNA和蛋白水平上明显增加,干性指标(CD133、CD44、NANOG、SOX2、OCT4)在RNA水平上明显增加。肺癌细胞表达MMP2较低,但肺癌相关MSCs高表达MMP2;肿瘤相关MSCs能够促进MMP2 RNA水平的表达。结论:本课题成功分离并鉴定了肺癌组织来源的肺癌相关MSCs,首次通过体内外实验明确肺癌相关MSCs能够促进肺癌细胞的转移,这一作用与肺癌相关MSCs促进肺癌细胞EMT转化、增强干性以及肺癌相关MSCs高分泌MMP2有关。本研究有力证明了肺癌相关MSCs与肿瘤细胞的相互作用,为深入研究间充质干细胞与肿瘤及其微环境之间的相互联系提供了理论依据。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2
【图文】：

细胞形态,成软骨细胞,切片染色,脱蜡

固定成软骨细胞球，进行石蜡包于组化罐中进行脱蜡和脱水，后，完成后将切片放于自来水冲洗分离所得细胞形成的成软骨切片染色效果（染色部分是软骨组织的形态特点养 3 天时，于显微镜下进行观壁细胞，呈长梭形；约 14 天左化传代，约 1 周左右细胞达到，传代后细胞呈典型成纤维细胞行排列（图 1）。

生长曲线,生长曲线,细胞,快速生长期

培养 3 天时，于显微镜下进行观察发贴壁细胞，呈长梭形；约 14 天左右，消化传代，约 1 周左右细胞达到 80%代，传代后细胞呈典型成纤维细胞状平行排列（图 1）。图 1 肺癌相关 MSCs 的细胞形态（10s 的生长曲线分离所得细胞的生长曲线呈 S 型，细4~48h 的潜伏期，细胞进入快速生长期，细胞的增殖及生长趋势放缓，进入

表型检测,硕士学位论文,流式,表型

天津医科大学硕士学位论文一、肺癌相关 MSCs 的分离、培养及鉴定1.2.3 肺癌相关 MSCs 的表型特点流式检测该分离所得细胞表面标志物结果显示，该细胞表达 CD73（99.8%）、CD90（99.8%）、CD105（57.1%）和 CD166（98.0%），不表达 CD14、CD19、CD34、CD45 和 HLA-DR（图 3）。

【参考文献】