circSETD3在非小细胞肺癌吉非替尼获得性耐药中的作用研究

发布时间：2020-08-22 15:27

【摘要】：目的:研究环状RNA分子circSETD3在非小细胞肺癌吉非替尼获得性耐药产生过程中的作用及其分子机制,为临床非小细胞肺癌吉非替尼获得性耐药的早期诊断与干预提供新的生物标志物和治疗靶标。方法:选取吉非替尼敏感性非小细胞肺癌细胞株H292(简称为H292_S)和PC 9(简称为PC 9_S),采用逐步递增法构建吉非替尼获得性耐药细胞模型(分别命名为H292_R和PC 9_R);CCK-8和Western blotting法检测耐药前后细胞对吉非替尼的敏感性变化;RNA测序(RNA sequencing,RNA-seq)法筛选耐药前后差异表达的circRNAs;Real-time PCR法验证RNA测序的筛选结果;构建circSETD3过表达和敲低的非小细胞肺癌细胞模型,通过CCK-8和流式细胞技术观察其对细胞吉非替尼敏感性的影响;生物信息学分析及双荧光素酶报告实验筛选并验证circSETD3与微小RNA(microRNA,miRNA)miR-520h的相互作用;生物信息学分析、Real-time PCR以及Western blotting法对circSETD3—miR-520h—ABCG2之间的三元关系进行分析鉴定。结果:1.耐药前后差异表达的circRNAs的筛选及验证:Real-time PCR方法验证了6个共同上调的circRNAs在敏感株和耐药株中的表达情况。结果表明:has_circ_0000567、has_circ_0000620、has_circ_0000655、has_circ_0006867这4个环状RNA在2种耐药株中均表达上调(P0.05);has_circ_0001147在2种耐药株中均表达下调(P0.05)。其中has_circ_0000567(circSETD3)的差异变化最明显。2.circSETD3功能研究:CCK-8结果表明,与阴性对照组相比,circSETD3过表达会提高细胞的生长增殖能力,而circSETD3敲低组细胞的增殖能力显著降低。流式细胞仪检测结果表明,与阴性对照组相比,circSETD3过表达组的细胞凋亡能力显著下降,然而circSETD3敲低组的细胞凋亡能力明显增强。3.circSETD3作用机制研究:首先,对circSETD3和miR-520h二元关系的验证。荧光定量PCR结果表明,在H292_S和PC 9_S细胞中过表达circSETD3后,细胞中miR-520h的表达水平均降低;而在H292_R和PC 9_R细胞中敲低circSETD3后,细胞中miR-520h的表达水平均升高。其次,对mi R-520h和ABCG2二元关系的验证。荧光定量PCR结果表明,在H292_S和PC 9_S细胞中转染miR-520h mimics后,细胞中ABCG2的表达量均降低;而在H292_R和PC 9_R细胞中转染miR-520h inhibitor后,细胞中ABCG2的表达量均升高。最后,对circSETD3—miR-520h—ABCG2三元关系的验证。当在H292_S和PC 9_S细胞中过表达circSETD3后,ABCG2的表达水平均升高,在此基础上转染miR-520h mimics后,ABCG2的表达水平均降低,其经典底物Hoechst 33342的胞内蓄积浓度随之升高;当在H292_R和PC 9_R细胞中干扰circSETD3后,ABCG2的表达水平均降低,在此基础上转染miR-520h inhibitor时,ABCG2的表达水平均升高。结论:环状RNA分子circSETD3在非小细胞肺癌吉非替尼获得性耐药的产生过程中出现表达上调,降低了细胞对吉非替尼的药物敏感性;circSETD3主要通过ceRNA机制发挥其生物学功能:circSETD3通过下调miR-520h的表达,解除miR-520h对外排性转运蛋白ABCG2的降解作用,从而使ABCG2对细胞内吉非替尼的外排功能增强,最终导致吉非替尼获得性耐药的产生。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2
【图文】：

存活率,细胞,获得性耐药,半数抑制浓度

3 结果3.1 吉非替尼获得性耐药非小细胞肺癌细胞株的验证CCK-8 结果显示，吉非替尼对 H292_S 和 H292_R 细胞生长增殖的半数抑制浓度（Half maximal inhibitory concentration，IC50）分别为 108.63 nmol/L 和 982.37nmol/L，耐药指数为 9.04；吉非替尼对 PC9_S 和 PC9_R 细胞生长增殖的 IC50值分别为 752.56 nmol/L 和 7875.62 nmol/L，耐药指数为 10.5（图 3.1.1）。Western blotting 结果表明，与吉非替尼敏感株 H292_S、PC9_S 细胞相比，耐药株 H292_R、PC9_R 细胞用吉非替尼（1.5 μmol/L）处理后，p-EGFR、p-PI3K、p-AKT 表达下降的幅度显著减少，而总的 EGFR、PI3K、AKT 表达量没有明显变化（图 3.1.2）。由于 p-EGFR、p-PI3K、p-AKT 是 EGFR 通路的活化形式，因此该结果表明在耐药细胞 H292_R、PC9_R 中，吉非替尼处理后对 EGFR 信号通路的抑制功能显著下降，细胞对吉非替尼的敏感性显著降低。

信号通路,获得性耐药,生物信息学分析,前后差异

图3.1.2吉非替尼对敏感细胞（H292_S和PC9_S）和耐药细胞（H292_R和PC9_R）EGFR/PI3K/AKT信号通路的影响Fig 3.1.2 the effects of gefitinib on EGFR/PI3K/AKT signaling pathway in Parental Cells（H292_S and PC9_S）and resistant cells（H292_R and PC9_R）were detected by Westernblotting (*:P＜0.05, vs the control group, n=3)3.2 非小细胞肺癌细胞株吉非替尼获得性耐药前后差异表达 circRNAs的筛选提取吉非替尼敏感性与耐药性非小细胞肺癌细胞株总 RNA，进行 RNA-seq 分析。采用 RPM （spliced reads per millon, RPM）法计算 circRNAs 的表达量，并利用生物信息学分析共同绘制差异表达 circRNAs 的火山图（图 3.2.1）。图中灰色为没有显著性差异的 circRNA；红色为显著性上调的 circRNAs（P＜0.05 且 FC≥2）；绿色为显著性下调的 circRNAs（P＜0.05 且 FC≥2）。RNA-seq 测序结果表明，

散点图,差异表达,火山,散点图

图 3.2.1 敏感细胞和耐药细胞中差异表达 circRNA 分布的火山散点图。左：H292_S vs H292_R;右：PC9_S vs PC9_RFig3.2.1 The volcanic scatter plot of the differentially expressed circRNAs in cell lines. Left:H292_S vs H292_R; right: PC9_S vs PC9_R图 3.2.2 H292_S vs H292_R 中，24 个 circRNA 显著上调； PC 9_S vs PC 9_R 中，25 个 cirRNA显著上调，其中有 6 个 cirRNA 共同上调（P＜0.05 且 FC≥2）

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