Galectin-9在肝癌中的表达调控机制及对肿瘤生物学行为的影响

发布时间：2020-08-25 07:31

【摘要】：第一部分IFN-γ对肝癌细胞系表达galectin-9和EZH2的作用目的研究在IFN-γ刺激下肝癌细胞系中galectin-9和EZH2表达情况方法使用重组人IFN-γ刺激Hep G2和Hep3B肝癌细胞系,模拟类似乙型病毒性肝炎相关肝癌中的高IFN-γ免疫微环境。在不同浓度IFN-γ刺激下和不同刺激时间下,使用免疫印迹法(western blot)和q PCR分别检测Hep G2和Hep3B细胞中galectin-9和EZH2蛋白和RNA水平的变化。在浓度梯度和时间梯度确定合适的IFN-γ浓度和刺激时间后,使用免疫荧光方法分别检测Hep G2和Hep3B细胞中galectin-9和EZH2的表达,直观显示galectin-9和EZH2在IFN-γ刺激下的变化趋势。结果在IFN-γ刺激下,galectin-9的表达明显上调,且呈明显的浓度依赖性和时间依赖性。同时,我们发现EZH2的表达跟galectin-9呈现相同的趋势。结论IFN-γ刺激下,肝癌细胞系Hep G2和Hep3B中galectin-9和EZH2表达增加。第二部分EZH2通过mi R-22调控galectin-9在肝癌细胞系中的表达目的研究EZH2通过何种方式调控galectin-9在肝癌细胞系中的表达方法首先,我们从三条EZH2特异性的小干扰RNA中筛选出两条EZH2敲低效果最明显的用于后续实验。在肝癌细胞系Hep G2和Hep3B中分别转染这两条si RNA后,分别使用western blot和q PCR检测galectin-9在蛋白和RNA水平的变化。然后,构建EZH2的过表达质粒载体p CMV-EZH2,将其转染肝癌细胞系Hep G2和Hep3B,验证过表达EZH2效果的同时,在蛋白和RNA水平检测galectin-9的变化趋势。最后,在使用IFN-γ刺激肝癌细胞系Hep G2和Hep3B的同时,转染si EZH2,分别检测EZH2敲低对IFN-γ诱导的galectin-9表达的影响。通过生物信息学方法预测可能在EZH2和galectin-9中起节点作用的mi RNA,构建galectin-9 3’UTR区域的双荧光素酶载体psi CHECK2-galectin-9,进一步验证mi RNA对galectin-9的调控作用,并转染相应的mi RNA的类似物及抑制剂后检测galectin-9蛋白水平的改变。确定调控galectin-9的mi RNA后,我们进一步分别检测了EZH2的过表达和敲低对该mi RNA表达的影响。从而证实EZH2通过该mi RNA间接调节galectin-9的表达。结果研究结果表明,使用si RNA敲低EZH2表达后,galectin-9表达在蛋白和RNA水平均明显下调。而过表达EZH2后,galectin-9的表达则明显上调,而且敲低EZH2可部分阻断IFN-γ诱导的galectin-9上调。生物信息学预测及后续验证表明mi R-22通过转录后途径调节肝癌细胞中galectin-9的表达。而肝癌组织及细胞系中EZH2均与mi R-22表达呈负相关,过表达和敲低实验证实EZH2通过mi R-22间接调控galectin-9的表达。结论EZH2通过mi R-22间接调控galectin-9在肝癌细胞中表达。第三部分EZH2通过MIR22HG启动子区域组蛋白甲基化抑制mi R-22表达目的研究EZH2抑制mi R-22表达的分子机制方法mi R-22在肝癌细胞系中的表达与其母基因MIR22HG类似,有研究表明mi R-22由MIR22HG转录后剪切加工而成。我们通过UCSC检索MIR22HG的启动子区域,发现一个长达858 bp的甲基化岛。针对这一区域我们设计了甲基化特异性引物,通过Hep G2和Hep3B细胞系甲基化特异性PCR(MSP)了解这一区域的DNA甲基化状态。然后我们又在24对肝癌及癌旁组织中进行MSP检测,进一步了解组织中这一区域的DAN甲基化状态。然后,我们又对这一Cp G岛进行了亚硫酸盐测序PCR(BSP)检测其甲基化状态。为了进一步明确mi R-22启动子区域的核心序列,我们将一系列mi R-22启动子区的5’端截短序列克隆至p GL3Basic载体的多克隆位点,将其与p RL-TK共转染肝癌细胞系后,双荧光素酶报告基因分别检测其荧光强度。确定启动子区的核心序列后,我们针对这一区域设计了特异性的Ch IP引物,然后分别使用EZH2、H3K27me3、Ig G抗体在EZH2敲低、过表达的肝癌细胞系中,进行染色质免疫共沉淀实验检测在这一核心区域相应蛋白的富集情况。为了进一步验证Ch IP实验的结果,我们检索了ENCODE(Encyclopedia of DNA elements)在线数据库,来研究这一区域相关蛋白的富集情况。结果我们在mi R-22转录起始位点附近发现了长约858bp的甲基化岛,细胞和组织的甲基化特异性PCR结果均显示mi R-22启动子区域呈低DNA甲基化状态。亚硫酸盐测序PCR同样证明这一区域呈低甲基化状态。双荧光素酶报告基因检测启动子区域5’端的截短载体活性发现,mi R-22转录起始位点上游-337~-65区域为启动子核心序列。在EZH2敲低、过表达、及对照细胞中分别进行染色质免疫共沉淀检测发现EZH2、H3K27me3在这一核心区域明显富集,EZH2敲低可显著降低其在这一区域的富集状态。ENCODE数据库中EZH2抗体在Hep G2细胞中的Ch IP-seq数据与我们的结果相似。结论EZH2通过mi R-22启动子上游核心序列的组蛋白H3赖氨酸K27的三甲基化抑制mi R-22的转录,而非通过DNA的超甲基化。第四部分mi R-22和galectin-9对肝癌恶性生物学行为的影响目的在体内和体外水平研究mi R-22和galectin-9对肝癌细胞系Hep G2恶性生物学行为的影响方法使用嘌呤霉素筛选稳定转染mi R-22前体及空白载体的Hep G2细胞系,筛选出稳定转染转细胞株后,将其分别共转染galectin-9过表达载体。Western blot检测各稳转细胞系中galectin-9的表达水平。CCK-8细胞增殖实验检测各细胞系的增殖能力,流式细胞凋亡检测分析凋亡细胞比例,并使用western blot检测凋亡相关蛋白caspase-3、活化的caspase-3、BAX以及Bcl-2的表达。为了评估各细胞系的恶性行为,平板克隆形成实验检测其定植能力,并使用transwell迁移和侵袭实验分别评估Hep G2细胞系的转移和侵袭的能力。裸鼠皮下成瘤实验评估各细胞系体外成瘤的能力,免疫组化分析各组瘤体中Ki-67及CD31表达情况。裸鼠肿瘤肺转移模型来检测各Hep G2细胞系远处转移能力。结果稳定转染mi R-22前体的Hep G2细胞中galectin-9表达下调,CCK-8细胞增殖试验提示mi R-22过表达能抑制肿瘤细胞增殖;流式细胞凋亡检测记过显示过表达mi R-22前体细胞中凋亡比例明显增加;克隆形成实验证明过表达mi R-22细胞克隆形成能力明显下降;transwell转移和侵袭实验证明mi R-22的表达明显抑制Hep G2细胞的转移和侵袭能力。共转染galectin-9后,有意思的是galectin-9和mi R-22一起协同抑制细胞增殖,促进凋亡,抑制克隆形成能力和转移及侵袭能力。动物实验中,成瘤实验和肿瘤肺转移实验均证实mi R-22和galectin-9可协同抑制移植瘤的形成并抑制其转移。结论mi R-22与galectin-9协同抑制肝癌细胞增殖,促进其凋亡,抑制其转移和侵袭能力。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7
【图文】：

浓度依赖性,肝癌细胞,胰岛素反应,肝癌细胞系

华中科技大学博士学位论文间差异使用 Student t 检验进行分析。结果1. IFN-γ 刺激对肝癌细胞系 galectin-9 表达的作用1.1. IFN-γ 浓度梯度对 galectin-9 表达影响分别使用 PBS 以及浓度为 0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml 的 IFN-γ 刺激人肝癌细胞系 HepG2 及 Hep3B。24 小时后检测 galectin-9 在 RNA 和蛋白水平表达的改变，IRF1（胰岛素反应因子 1）作为阳性对照。我们发现随着 IFN-γ 浓度的增高，galectin-9 表达上调，呈明显浓度依赖性（图 1- 1）。

肝癌细胞,时间依赖性,浓度依赖性,胰岛素反应

IRF1（胰岛素反应因子 1）作为阳性对照。我们发现随着 IFN-γ 浓度的增高，galectin-9 表达上调，呈明显浓度依赖性（图 1- 1）。.2. IFN-γ 刺激的时间对 galectin-9 表达的影响使用终浓度为 10ng/ml 的 IFN-γ 刺激肝癌细胞，在不同时间点检测 galectin-9 及IRF1 的表达，发现 galectin-9 表达上调呈时间依赖性（图 1- 2）。图 1- 1 IFN-γ 刺激下，肝癌细胞中 galectin-9 及 IRF1 表达上调，且呈浓度依赖性。

肝癌细胞,浓度依赖性,染色质构象,调控基因

中科技大学博士学位论在 IFN-γ 刺激下 EZH2 表达上调表明 IFN-γ 刺激能调节相关基因启动子区域的组蛋白 H3 第化水平，改变染色质构象，从而调控基因的表达。EZH2 是的关键酶，因此我们研究在 IFN-γ 不同浓度及刺激时间作用。结果表明，EZH2 同样呈现出浓度及时间依赖性（图 1- 3

【参考文献】