细胞因子TNF-α诱导的肝癌细胞HepG2的mRNA-miRNA-circRNA表达谱关联分析

发布时间：2020-08-26 12:57

【摘要】：环状RNA(circular RNA,circRNA),与线性RNA(linear RNA,含5’和3'端)不同,是一类呈封闭环状的特殊内源RNA分子,因此在细胞中不受RNA外切酶的影响,表达更稳定且不易降解。近年相关的研究表明,circRNA分子含有microRNA(miRNA)和RNA结合蛋白(RBP)结合位点,在细胞中起到miRNA海绵和反式作用因子的作用,对疾病的发生发展中发挥着重要的作用。环状RNA作为一类新型的内源RNA分子,从形成的机制到生物学功能越来越受到研究者的关注。肿瘤坏死因子TNF-α是主要由脂多糖刺激巨噬细胞而产生、具有丰富生物活性的细胞因子,能够与靶细胞膜上的TNFR结合,然后通过受体介导相应的信号通路将信息传递到胞核,促进目的基因表达进而合成蛋白质,并与其他细胞因子共同作用,激活免疫反应,导致肿瘤坏死。本研究以正常人肝细胞HL-7702,肝癌细胞HepG2和使用肿瘤坏死因子TNF-α诱导3小时的肝癌细胞HepG2_3h为实验样本并分为两个实验组,分别对其总RNA进行去rRNA链特异性RNA测序及small RNA表达谱测序,对测序数据利用生物信息学方法获取mRNA、circRNA及microRNA表达谱数据,对表达谱数据进行关联分析,筛选出了可能与TNF-α相关的circRNA-miRNA-mRNA调控网络关系,为进一步从分子生物学实验中寻找肿瘤发生相关的非编码RNA及其调控关系研究提供一定的生物信息学理论依据。本课题主要分为以下三个部分:1.对HL-7702正常人肝细胞及TNF-α处理前后的HepG2肝癌细胞的全转录组测序结果从碱基质量和碱基分布两个方面进行了质量评估,结果表明我们的测序数据质量可靠,进一步的生物信息学分析可以开展。然后,对三个样本的circRNA进行了预测,并对circRNA的表达数量,基因组不同区间的分布、mapping到基因组各个染色体的reads以及back-splicing reads以及circRNA的长度进行了统计分析,发现与之前关于人类环状RNA相关研究的结果基本相一致,预测结果的可信度比较高。2.对TNF-α处理前后的HepG2肝癌细胞及HL-7702正常人肝细胞的circRNA进行了差异表达分析和来源基因的功能注释,主要包括GO功能富集分析和KEGG Pathway分析。首先对三个样本的circRNA表达水平进行了定量和归一化,比较不同样本间的差异表达情况,挑选出表达差异明显的circRNA。最后对挑选出的差异明显的circRNA来源基因进行了功能注释和通路分析,发现在表达下调的circRNA中,其对应的host gene富集的GO条目与肿瘤高度相关,如细胞周期,细胞迁移等。与此同时,信号通路分析发现两条与癌症相关的信号通路:hsa04120:Ubiquitin mediated proteolysis,hsa04012:ErbB signaling pathway。研究发现,TNF-α处理后,很多与细胞代谢凋亡相关的基因转录出的circRNA的表达量有明显的变化,说明TNF-α可能诱导细胞凋亡的途径可能与circRNA有关。3.对正常人肝细胞HL-7702,肝癌细胞HepG2及TNF-α诱导3小时的HepG2细胞的circRNA,miRNA和mRNA的表达谱关联分析,发现17个在三个样本中表达变化非常明显的circRNA,通过对这17个circRNA对应的相互调控miRNA的kegg通路分析,我们发现有3个miRNA对应的10个靶标基因富集在与TNF-α关联密切的NF-kappa B通路中。结合mRNA表达谱数据,我们预测肝细胞癌变后,hsa_circ_0112428,hsa_circ_0004027,hsa_circ_0107593,hsa_circ_0005524,hsa_circ_0003511,hsa_circ_0008077这6个circRNAs的表达量下降,细胞中表达出的hsa-miR-3911与TNFSF14转录出的mRNA结合,从而负向调控TNFSF14蛋白的表达。当肝癌细胞经过TNF-α处理后,6个circRNAs的表达量上升,它们可以作为像海绵一样竞争性结合hsa-miR-3911,使其不能与TNFSF14转录出的mRNA结合,从而正向调控TNFSF14蛋白的表达,诱导肿瘤细胞凋亡。
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7;Q811.4
【图文】：

再切除内含子后形成 circRNA（如图1-1 A 所示）；而内含子配对驱动的环化主要是通过环化 RNA 两侧内含子区的ALU 重复序列( 即限制性内切核酸酶 AluⅠ的识别序列 AGCT) ，或其它 RNA二级结构，使两个内含子通过碱基互补配对形成环状结构后再切除内含子从而形成环状 RNA( 如图 1-1 B 所示)[15]。也有科学家研究发现一种现象叫做可变环化

图 1-2 转录组测序流程究内容肝癌细胞株 HepG2 在基因学及毒理学等研究中被广泛应用，对研发展机制及临床治疗有着非常重要的帮助。本课题选择正常人2，肝癌细胞 HepG2 和肿瘤坏死因子 TNF-α 诱导 3h 的肝癌细胞 H样本并分为两个实验组，利用 IlluminaHiseq2000 测序平台分别对NA 去 rRNA 后进行全转录组测序，采用生物信息学方法获得其数据，探索 TNF-α 对肝癌细胞中 circRNA 表达的影响；并结合项三个样本的 miRNA/mRNA 表达谱数据，对三者进行表达谱关联F-α 作用于的 circRNA、miRNA、mRNA 之间相互作用网络的初步结构如下：

15图 2-1 转录组测序（链特异）建库原理备的主要实验步骤如下：洗涤——磁珠需要在室温下使用，而且在使用之前必须保持试剂为：RNase-Free 水 225μl；磁珠 225μl，磁珠悬浮液 65试管，RiboGuard RNaseRiboGuard RNase Inhibitor1 μl。2°C 至 8°C 保存 Magnetic Core Kit 各组分，取出后，Magneti放置在冰上，要将其恢复至室温。Magnetic Beads 进行剧烈震荡保证其混匀充分。

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本文编号：2805203