闭锁小带-1相关核酸结合蛋白（ZONAB）促进膀胱癌侵袭作用的研究

发布时间：2020-08-27 18:49

【摘要】：目的:紧密连接(tight junction,TJ)是癌细胞侵袭转移过程中必须克服的首要屏障。癌细胞首先丧失细胞间连接,由原发灶解离,然后侵袭周围组织。闭锁小带-1相关核酸结合蛋白(zonula occludens-1 associated nucleic acid binding protein,ZONAB)是重要的紧密连接蛋白,也是转录因子,细胞密度增加时ZONAB结合于闭锁小带-1(zonula occludens-1,ZO-1),处于未激活状态,ZONAB被激活后进入细胞核,特异性地结合cyclinD1、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的启动子,起到促进细胞增殖的作用。在肝癌、结肠癌中ZONAB的表达上调,发挥促进癌细胞增殖的作用,但目前尚缺乏膀胱癌(bladder cancer,BC)中ZONAB表达情况的报道,虽然ZONAB作为转录因子促进细胞增殖的作用已被人们所知,而它能否影响肿瘤侵袭仍是未知数。本研究的目的是通过基因转染、离体实验、在体实验等多种方法,检测ZONAB在膀胱癌中的表达变异,并证明ZONAB表达对癌细胞侵袭力的影响,揭示膀胱癌侵袭的可能机制。研究方法:1、研究对象:选取患者为2014年至2016年之间于中国医科大学附属盛京医院医院泌尿外科收治并接受手术治疗,病理确诊尿路上皮癌,排除不合并泌尿系感染病变,包括30例肌层浸润性膀胱癌、41例非肌层浸润性膀胱癌和相应的癌旁非肿瘤组织(adjacent non-tumor tissue,ANTT)。研究样本取自手术切除的肿瘤组织和癌旁组织,其中部分组织固定后行病理检查及免疫组化实验,部分组织转移至-80℃冰箱中冻存。人尿路上皮永生细胞系sv-huc-1和膀胱尿路上皮癌细胞系5637、T24、UM-UC-3由中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(上海)购得。2、ZONAB过表达T24多克隆细胞系构建:在氨苄青霉素LB培养基中培养pLV-ZONAB-DU及其对照组pLV-GFP-DU菌液,收集菌体提取质粒,用紫外分光光度计测量OD260值,计算质粒浓度,慢病毒载体、pH1、pH2转染HET293T细胞,收集纯化病毒,将慢病毒悬液加入有T24细胞生长的完全培养基,然后加入凝聚胺至终浓度,以此替换原细胞培养基,加入嘌呤霉素筛选细胞,14天后冻存细胞。3、用shRNA使ZONAB表达沉默:根据ZONAB基因序列设计合成shRNA序列,用大肠杆菌提取质粒,慢病毒载体、pH1、pH2转染HET293T细胞,收集纯化病毒,用病毒感染UM-UC-3细胞,加入嘌呤霉素筛选细胞,14天后冻存细胞。4、Transwell细胞体外侵袭实验:将被稀释的基质胶加入transwell培养板上室,覆盖聚碳酯膜,上室加入单细胞悬液。下室加入趋化因子液,1天后去除基质胶和聚碳酯膜上表面的细胞。甲醇固定上室,苏木素染色,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,切取聚碳酯膜,放置于载玻片,中性树脂封片。在高倍镜下计数细胞。5、动物模型的制备:将各组T24细胞于裸鼠的双上肢腋下进行皮下注射,记录裸鼠瘤体各径线。6、Westem blotting技术:检测膀胱组织、培养的各组细胞系中各种蛋白的表达水平。7、realtime-PCR技术:检测膀胱组织、培养的各组细胞系中各种mRNA表达水平。8、免疫组化技术:观察和检测膀胱组织中各种蛋白的表达分布及强弱。9、HE染色:用于观察实验动物模型中膀胱癌原发灶的浸润情况。结果:一、膀胱癌中ZONAB的表达上调1、膀胱癌与癌旁非肿瘤组织中ZONAB mRNA的表达:采用realtime-PCR检测发现膀胱癌中ZONAB mRNA的表达较癌旁非肿瘤组织高。2、膀胱癌与癌旁非肿瘤组织中ZONAB蛋白的表达:采用Western blotting发现膀胱癌中ZONAB蛋白的表达高于癌旁非肿瘤组织。3、膀胱癌与癌旁非肿瘤组织中ZONAB蛋白的免疫组化染色:通过免疫组化法检测肌层浸润性膀胱癌、非肌层浸润性膀胱癌、癌旁组织中的ZONAB高表达率,发现膀胱癌中ZONAB高表达率高于癌旁组织,而且肌层浸润性膀胱癌中ZONAB的高表达率高于非肌层浸润性膀胱癌。4、膀胱癌中ZONAB蛋白表达与临床病理因素的相关性:通过对免疫组化法测得膀胱癌中ZONAB蛋白的表达阳性率的分析,我们发现ZONAB蛋白的表达高表达率在不同年龄、性别、淋巴结转移及远隔转移等临床病理因素中均未表现出明显差异。5、各种人尿路上皮细胞系中ZONAB mRNA的表达:采用realtime-PCR检测人膀胱癌细胞系5637、T24、UM-UC-3和人尿路上皮永生细胞系sv-huc-1中ZONAB mRNA的表达,可见膀胱癌细胞系中ZONAB mRNA的表达较正常尿路上皮细胞系中的表达高。6、各细胞系中ZONAB蛋白的表达:采用Western Blot法检测人膀胱癌细胞系5637、T24、UM-UC-3和人尿路上皮永生细胞系sv-huc-1中ZONAB蛋白的表达,可见膀胱癌细胞系中ZONAB蛋白的表达较正常尿路上皮细胞系中的表达高。二、ZONAB过表达的T24细胞系侵袭力增强1、ZONAB过表达的T24膀胱癌细胞系模型建立:通过慢病毒载体稳定转染人膀胱癌细胞系T24,用ZONAB表达载体pLV-ZONAB-DU包装为ZONAB表达慢病毒,用表达ZONAB慢病毒分别感染T24细胞,筛选表达ZONAB的T24细胞株。通过Western blotting验证表达ZONAB的T24细胞系(T24-ZONAB)中ZONAB蛋白呈稳定较高表达。2、不同ZONAB表达水平的T24膀胱癌细胞系的侵袭力检测:通过Transwell小室侵袭实验测得T24-P(空白对照)、T24-GFP(阴性对照)以及T24-ZONAB 3组细胞的侵袭率率。T24-ZONAB的侵袭率明显高于对照组。三、ZONAB表达下调的UM-UC-3细胞系侵袭力减弱1、ZONAB表达下调的UM-UC-3膀胱癌细胞系模型建立:通过慢病毒载体shRNA转染人膀胱癌细胞系UM-UC-3,筛选ZONAB表达下调的UM-UC-3细胞株。通过Western blotting验证ZONAB表达下调。2、不同ZONAB表达水平的UM-UC-3膀胱癌细胞系的侵袭力检测:通过Transwell小室侵袭实验测得UM-UC-3-P(空白对照)、UM-UC-3-N(阴性对照)以及UM-UC-3-R(实验组)3组细胞的侵袭率率。UM-UC-3-R的侵袭率明显低于对照组。四、在体研究证实ZONAB表达促进膀胱癌侵袭1、膀胱癌异种移植物动物模型:T24-ZONAB组肿瘤生长速度明显高于T24-P及T24-GFP组,肿瘤直径明显大于其他两组,提示ZONAB表达具有促进肿瘤细胞增值的作用。2、不同ZONAB表达水平的膀胱癌细胞的转移及侵袭检测:小动物荧光成像发现T24-ZONAB裸鼠膀胱癌模型中肿瘤原发灶有明显的荧光,提示膀胱癌原发灶有稳定的ZONAB高表达,但未发现明确的远隔转移灶。HE染色发现T24-P组与T24-GFP组肿瘤边缘未发生周围组织侵袭,而T24-ZONAB组原发灶周围可见多处癌细胞横纹肌侵袭,提示ZONAB表达有促进肿瘤侵袭的功能。结论:1、膀胱癌中ZONAB表达上调。2、肌层浸润性膀胱癌中ZONAB表达高于非肌层浸润性膀胱癌。3、ZONAB表达有促进肿瘤侵袭的作用。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.14
【图文】：

ltime-PCR法检测癌旁非肿瘤组织（ANTT）、膀胱癌（BC）中ONAB mRNA表达明显高于癌旁组织。与内参GAPDH表达进行校标准化。以平均值±标准差的形式表述，*表示P < 0.05，。癌旁非肿瘤组织中 ZONAB 蛋白的表达ernblot 法检测癌旁非肿瘤组织与膀胱癌中 ZONAB 癌中 ZONAB 蛋白的表达高于癌旁非肿瘤组织，膀胱癌旁非肿瘤组织中表达表达量的 2.3 ± 0.4 倍（P <

法检测癌旁非肿瘤组织与膀胱癌中 ZONAB 蛋白的表达（图2），可见膀胱癌中 ZONAB 蛋白的表达高于癌旁非肿瘤组织，膀胱癌中 ZONAB 蛋白的表达量为癌旁非肿瘤组织中表达表达量的 2.3 ± 0.4 倍（P < 0.05）。图 2，用 Western blotting 检测癌旁非肿瘤组织（ANTT）、膀胱癌（BC）中 ZONAB 蛋白的表达。上图为 2 例癌旁非肿瘤组织 N1 和 N2 和对应的 2 例膀胱癌组织 T1 和 T2 中 ZONAB 蛋白

中国医科大学博士学位论文的表达条带。下图为 ZONAB 的相对表达量柱状图。在膀胱癌中 ZONAB 蛋白表达明显高于癌旁组织。与内参 β -actin 表达进行校正后的相对表达，并相对 ANTT 进行标准化。以平均值±标准差的形式表述，*表示 P < 0.05，t-检验。每对组织重复 3 次独立实验。3.3 膀胱癌与癌旁非肿瘤组织中 ZONAB 蛋白的免疫组化染色免疫组化染色测得癌旁非肿瘤组织和膀胱癌组织中的 ZONAB 蛋白表达，在癌旁正常组织中可见位于粘膜最上层的细胞膜深染，在膀胱癌组织中可见细胞核深染，证明膀胱癌中 ZONAB 蛋白脱离细胞膜紧密连接部位，进入细胞核（图 3）。膀胱癌组织中 ZONAB 高表达率为 38.0%（27/71），高于癌旁非肿瘤组织 19.7%（14/71）（P < 0.05）（图 4）。

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本文编号：2806480