HSP27对分子大汗腺型乳腺癌的影响及作用机制

发布时间：2020-08-28 00:20

【摘要】：目的分子大汗腺型乳腺癌(molecular apocrine breast cancer,MABC)是近年来提出的一种新的乳腺癌分子亚型,其免疫表型特征是雌激素受体(estrogen receptor,ER)和孕激素受体(progesterone receptor,PR)表达阴性,而雄激素受体(androgen receptor,AR)表达阳性。本研究分析MABC与相关临床病理学指标的关系以及MABC患者的临床预后;探索AR和热休克蛋白27(heat shock protein 27,HSP27)对MABC的影响及相关作用机制。方法1、随机选取浸润性乳腺癌组织样本500例,免疫组化法检测ER,PR,AR,HSP27,人表皮生长因子受体2(epidermal growth factor receptor 2,HER2)和Ki67的表达情况,根据ER,PR和AR的表达将所有样本分为MABC组和非分子大汗腺型乳腺癌(nonMABC)组,分析HSP27与AR表达的相关性,以及MABC患者的预后。2、选取具有MABC表型的MDA-MB-453细胞系和具有nonMABC表型的MCF7细胞系,CCK8及平板克隆实验分析雄激素二氢睾酮(dihydrotestosterone,DHT)刺激AR活化和下调HSP27对MABC细胞增殖能力的影响;免疫荧光和Western blot分析AR和HSP27表达及定位;免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)检测AR-HSP27复合物的形成。构建HSP27磷酸化位点的突变体,包括15、78和82位丝氨酸,Western blot、实时定量PCR(qPCR)和免疫荧光检测AR的表达及定位,分析影响AR入核的关键HSP27磷酸化位点。3、选取MABC和nonMABC样本各205例,分析MABC患者发生远处转移的时间及部位、对术后放化疗的敏感性;将MDA-MB-453细胞分为三组:HSP27下调组、DHT刺激组和对照组,将2×10~6细胞注射到双免疫缺陷小鼠皮下脂肪垫,观察肿瘤的形成及转移情况。结果1、MABC肿瘤有更高的组织学分级(P0.001)、肿瘤体积(P0.001)、病理学TNM分期(pTNM,P0.001)和淋巴结转移率(P0.001);相对于nonMABC,HSP27在MABC中的阳性表达率更高(P=0.013);MABC中,HSP27的表达与肿瘤组织学分级(P0.001)、肿瘤大小(P=0.044)、pTNM分期(P=0.046)、Ki67表达(P0.001)以及HER2表达(P0.001)有关;此外,相对于nonMABC,MABC患者的无病生存率(Disease-free survival,DFS)和总生存率(Overall survival,OS)更低(P0.001),HSP27阳性表达者有更差的DFS和OS(P=0.024,P=0.025)。2、选取MABC表型的MDA-MB-453细胞和nonMABC表型的MCF7细胞,检测ER、PR和AR的表达情况,结果显示MDA-MB-453细胞中ER和PR表达阴性、AR表达阳性,MCF7细胞中ER、PR和AR均表达阳性,符合本实验的要求;CCK8实验验证DHT的最佳作用浓度为10^-8M且作用时间为48小时;分别用碳处理血清或碳处理血清加DHT培养细胞,结果发现DHT对MDA-MB-453细胞的增殖能力具有促进作用,而对MCF7细胞具有抑制作用。3、DHT刺激能够促进MDA-MB-453和MCF7细胞中AR和pHSP27-S82蛋白的表达,对HSP27总蛋白、pHSP27-S15和pHSP27-S78表达没有影响;并且DHT能够促进AR基因的表达,而对HSP27基因表达没有影响。分别提取核浆蛋白,Western blot分析显示DHT能够诱导MDA-MB-453细胞中AR和HSP27在胞核中表达增多、胞浆中表达降低;MCF7细胞中,只有AR在胞核中表达增多、胞浆中表达降低,而HSP27没有变化。4、提取总蛋白,Co-IP分析显示DHT刺激后,MDA-MB-453和MCF7细胞中均有AR-HSP27复合物的存在;核浆蛋白分离提取,结果显示MDA-MB-453细胞中AR-HSP27复合物存在于胞浆和胞核中,而MCF7细胞中仅在胞浆中能够检测到复合物。5、下调HSP27的表达,MDA-MB-453细胞增殖能力降低,但这种效果可被DHT刺激所减弱,即HSP27下调和DHT刺激AR活化具有相反的作用;MCF7细胞中,HSP27的下调抑制细胞的增殖能力,DHT刺激后这种作用增强,即HSP27下调和DHT刺激AR活化具有相同的作用。HSP27下调可同时减少AR蛋白的表达,但是对AR基因表达没有影响;并且HSP27下调能够阻止MDA-MB-453和MCF7细胞中AR的入核。6、分别突变HSP27的三个磷酸化位点,包括pHSP27-S15、pHSP27-S78和pHSP27-S82,Western blot和免疫荧光得出相同的结果:只有pHSP27-S82突变的细胞中,胞核内AR的表达降低,即pHSP27-S82在AR入核过程中具有关键性的作用。7、相对于nonMABC,MABC患者发生远处转移的时间更早(P0.001),相关因素包括:肿瘤的组织学分级(P=0.003)、肿瘤大小(P=0.019)、淋巴结转移率(P=0.035)、TNM分期(P=0.017)、以及HER2(P=0.033)、Ki67(P=0.044)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF;P=0.004)的表达状态。MABC更倾向于发生肺(P=0.010)、肝(P=0.044)和脑(P=0.048)转移,而nonMABC更倾向于发生骨转移(P=0.012)。此外,接受术后放疗加化疗的nonMABC患者相对于只接受术后化疗的患者有更好的无远处转移生存率(Distant metastasis-free survival,DMFS;P=0.042)、DFS(P=0.005)和OS(P=0.017),而对MABC患者没有显著影响(P0.05)。8、动物实验结果显示,DHT刺激AR活化后能够增强MDA-MB-453细胞的成瘤能力、加快移植瘤生长速度、诱导癌细胞发生肝转移;而HSP27下调能够抑制移植瘤形成率及肿瘤的生长和转移。DHT刺激AR活化后,移植瘤内细胞的增殖能力增强、凋亡率降低;HSP27下调后,移植瘤细胞增殖能力减弱、凋亡率增加。结论MABC是一种具有高度恶性的肿瘤,HSP27的阳性表达率高,患者发生远处转移的时间更早,生存期更短;AR和HSP27在诱导MABC恶性表型机制中发挥着重要作用;联合AR和HSP27为治疗靶点或许能为MABC患者选择新的治疗方案提供依据。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9
【图文】：

免疫组化,部位,放大倍数,指标

?1.1B）、HER2 的阳性着色部位位于癌细胞胞膜（图 1.1C）、Ki67 的阳性着色部位位于癌细胞胞核（图 1.1D）、AR 的阳性着色部位位于癌细胞胞核（图1.1E）、HSP27 的阳性着色部位位于癌细胞胞浆（图 1.1F）。根据 ER、PR 和AR 的表达状态，我们将所有的样本分为两个亚组，即 158 例 MABC 亚组（ER-PR-AR+）和 342 例 nonMABC 亚组，图 1.2 展示了一组病例在组织学分类归属于伴大汗腺分化的癌，而根据乳腺癌的分子分型属于 MABC 亚型，即 ER和 PR 表达阴性，且 AR 表达阳性。

组织学分类,大汗腺,免疫表型,亚组

士学位论文一、AR 和 HSP27 对 MABC 肿瘤影响的研究16图1.2 组织学分类归属于伴大汗腺分化的癌1例（A），免疫表型属于MABC；AR表达阳性（B），ER（C）和PR（D）表达阴性（原始放大倍数200×）a和b分别是ER和PR的正常乳腺组织的阳性对照1.2.2 MABC 与 nonMABC 亚组中相关临床病理学指标之间的差异通过免疫组化结果分析得出 158 例浸润性乳腺癌样本 ER 和 PR 表达阴性且AR 表达阳性，归类于 MABC 亚组（31.6 %, 158/500），剩余的 342 例样本归类于 nonMABC 亚组（68.4 %, 342/500）。在 MABC 亚组中，36.7 % (58/158)属于HER2 过表达型乳腺癌，63.3 % (100/158)属于 TNBC。相关的临床病理学指标与不同分子表型之间的差异在表 1.1 中显示，即组织学级别高的肿瘤更常见于MABC 亚组（P<0.001）；相对于 nonMABC

曲线图,生存分析,样本,曲线图

天津医科大学博士学位论文一、AR 和 HSP27 对 MABC 肿瘤影响的研究1.2.3 MABC与nonMABC的临床预后在本研究所选取的病例样本中，随访期间有 92 名患者发生了复发或远处转移，其中包括 54 例 MABC 患者和 38 例 nonMABC 患者。通过生存分析发现，MABC 相对于 nonMABC 患者的预后更差，MABC 患者的无病生存期及总生存期更短（P<0.001，图 1.3A 和 1.3B）。

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