胃癌患者口腔和胃内微生态的宏基因组学研究

发布时间：2020-08-28 17:45

　　胃癌是全世界最主要的公共健康问题之一,每年的新发病例超过100万。幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,HP)慢性感染已被证实是胃癌最重要的危险因素。基于高通量测序技术和生物信息学方法的人体微生物组研究使我们逐渐认识到除HP外,人体胃中还存在由其它多种微生物构成的微生态系统,它们与胃部疾病,包括胃癌的关系受到广泛关注。其中已有不少研究发现胃内菌群失调与胃癌关系密切,且一些特定菌群具有成为诊断胃癌的生物学标记物的潜力;也有一些研究发现口腔致病菌或共生菌在胃癌患者的胃内富集,但直接分析胃癌患者口腔微生物特征的研究少之又少。同时,这些关于微生物和胃癌关系的研究大都采用16S rRNA基因扩增子测序的方法,该方法在物种鉴定上一般只能精确到属的水平,且遗漏了微生物样本中除16S rRNA基因外的其它大量微生物基因的信息,在微生物功能的注释上也只能通过预测的方法。故本研究采用宏基因组学的方法分析胃癌(GC)患者和慢性浅表性胃炎(SG)患者胃内和口腔微生物的特征,通过全基因组对比研究,探索人体口腔和胃内菌群与胃癌的关系。本研究按照严格的纳入和排除标准成功招募了6名GC患者和5名SG患者,收集其胃冲洗液标本和漱口液标本进行宏基因组建库测序,并对测序数据进行质量控制,得到高质量、无宿主DNA污染的微生物DNA序列,再分别通过MetaPhlAn2和HUMAnN2对质控后的数据进行物种注释和功能注释,得到每个样本的物种组成及其相对丰度和代谢通路组成及其相对丰度。然后分析样本内微生物的Alpha和Beta多样性,采用LEfSe对两组间微生物组成结构和功能通路进行对比研究,以探索特定菌群、微生物代谢功能与胃癌的关系,并寻找胃癌生物学标志物。主要研究结果:1.通过宏基因组建库测序及数据质控,我们得到高质量的微生物DNA序列。MetaPhlAn2物种注释的结果中细菌DNA序列占比99.46±0.66%(mean±S.D.),其余为病毒序列,口腔样本和胃样本分别鉴定出204个和190个菌种;HUMAnN2功能注释结果中细菌代谢通路占比超过99%,口腔样本和胃样本分别鉴定出301个和349个微生物代谢通路。2.两组间微生物Alpha多样性分析结果显示:SG组胃内菌群的丰富度(Observed species)显著高于GC组,但两组Shannon Index无显著差异;SG组口腔菌群的丰富度和Shannon Index均高于GC组;提示SG组口腔和胃内菌群的多样性高于GC组。3.两组间微生物Beta多样性分析结果:基于Bray Curtis dissimilarity的PCoA分析显示,两组间胃内菌群的相对丰度在整体上差异不显著(PERMANOVA,R~2=0.164,P=0.067),但基于Jaccard Index的PCoA分析结果显示其差异显著(PERMANOVA,R~2=0.212,p=0.0037);以上两种方法的计算结果均显示,两组间口腔菌群整体上差异显著(Bray Curtis dissimilarity,R~2=0.221,P=0.002;Jaccard Index,R~2=0.232,P=0.017;PERMANOVA)。此结果说明两组间的菌群结构在整体上差异显著。4.两组间菌群差异分析及生物学标志物筛选结果:使用LEfSe对两组间胃内菌群进行比较分析显示,共有44种细菌分类的相对丰度在GC组和SG两组间存在显著性差异,其中包括8个菌科,12个菌属,18个菌种和6个菌株。我们根据菌种的平均相对丰度和流行度,首次发现了5个在GC组胃中显著富集的优势物种,包括奈瑟氏菌属、Alloprevotella、Aggregatibacter、Porphyromonas_endodontalis.t_GCF_000174815和Streptococcus_mitis_oralis_pneumoniae;首次发现优势物种矢野口鞘氨醇菌在SG组中富集。用同样的方法发现有13种细菌分类在GC组口腔样本中富集,并从其中筛选出3个优势物种,包括Alloprevotella、Porphyromonas_endodontalis.t_GCF_000174815和奈瑟氏菌属,此三种细菌同样在GC组的胃样本中富集,说明它们能在胃癌患者的上消化道大量增殖,具有成为胃癌标志物的潜力。5.两组间微生物代谢通路差异分析:PCoA分析发现,两组间口腔和胃内微生物的代谢功能在整体上差异显著。LEfSe分析显示,两组间共有34种胃内菌群的代谢通路存在显著性差异,而在口腔样本中这种差异分布的代谢通路共有55种,这些差异代谢通路主要涉及糖类、氨基酸、脂质、核苷酸的代谢。特别的,与细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)合成相关的代谢通路在GC组中富集,而与短链脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)生成相关的代谢通路在SG组中富集。综上所述,我们首次通过宏基因组学的方法分析了GC患者的口腔和胃内微生物的特征,并将其与SG患者比较,首次发现了一些与GC显著相关的菌种和微生物代谢通路,从全基因组的角度扩展了当前对消化道微生物在胃癌中的作用的认识,为寻找胃癌的预防、早期诊断和治疗的靶点提供了新的视角和信息。
【学位单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.2
【部分图文】：

相对丰度,细菌分类,慢性浅表性胃炎,口腔菌群

生物样本中一共鉴定出 190 类菌种。如图 3-1 所示，在门分类水平，G的胃菌群在相对丰度分布上无显著性差异（Mann-Whitney U test, p>0.05群都集中在变形菌门（41.84% in GC and 62.13% in SG）、拟杆菌门（41d 24.54% in SG）、厚壁菌门(11.88% in GC and 9.18% in SG)和梭杆菌门(3d 2.01% in SG)；然而在纲分类水平，GC 组的β变形菌和γ变形菌的相对 SG 组，SG 组的α变形菌的相对丰度显著高于 GC 组（Mann-Whitney5），此结果说明两组间胃内菌群的构成在纲分类水平上有显著差异。如图门分类水平上，GC 组和 SG 组的口腔菌群集中在拟杆菌门（42.58±6.63%.24±5.8% in SG）、变形菌门（33.19±7.73% in GC and 20.35±4.82% in S(15.20±6.5% in GC and 23.26±2.53% in SG)、放线菌门(3.58±2.00% in4.17% in SG)、梭杆菌门(3.12±2.2% in GC and 3.36±1.75% in SG)，且 S门的相对丰度显著高于 GC 组，差异有统计学意义（Mann-Whitney087），说明两组间口腔菌群在高分类水平上也存在显著差异，且受试者的群的构成显然不同。

柱状图,口腔菌群,细菌分类,相对丰度

26图 3-2 胃癌组（GC）与慢性浅表性胃炎组（SG）受试者口腔菌群的相对丰度在门分类水平的堆叠柱状图：GCm 和 SGm 分别表示两组受试者组内各细菌分类的均值。3.2.2 宏基因组多样性分析结果3.2.2.1 胃菌群多样性分析结果3.2.2.1.1 胃菌群 Alpha 多样性分析结果我们使用 observed species 和 Shannon Index 来评估受试者胃内菌群的 Alpha 多样性。SG 组的 observed species 显著高于 GC 组(Student's t-test, P=0.0118, 图 3-3A)；而两组间 Shannon Index 差异不显著(Student's t-test, P=0.46, 图 3-3B)。这说明 SG 组的胃菌群种类明显多于 GC 组；但是当同时把各菌种的相对丰度计算在内时，两组间微生物 Alpha 多样性差异不显著。

比较结果,胃腺癌,菌群,上差

图 3-3 两组间胃内菌群 Alpha 多样性比较：A：两组间 Observed species 比较结果，（Student'st-test, P=0.0118）；B：两组间 Shannon Index 比较结果（Student's t-test, P=0.46）； GC,胃腺癌；SG，慢性浅表性胃炎。3.2.2.1.2 胃菌群 Beta 多样性分析结果我们采用 PCoA 对两组间 Bray Curtis dissimilarity 和 Jaccard Index 进行分析，并使用 PERMANOVA 对分析结果进行统计检验。如图 3-4A，最主要的两个坐标轴（PCoA1 和 PCoA2）能够代表两组间 Bray-Curtis dissimilarity 差异的 52.62%；如图3-4B，最主要的两个坐标轴（PCoA1 和 PCoA2）能够代表两组间 Jaccard Index 差异的51.71%。两组样本在主坐标轴上能很好的分开，表示两组间胃内菌群在整体上差异明显。同时 PERMANOVA 分析表明，两组间在基于 Jaccard Index 的 PCoA 分析结果上的差异有统计学意义（R2=0.212,p=0.0037）,而基于 Bray-Curtis dissimilarity 的 PCoA分析结果上的差异无统计学意义（R2=0.164, P=0.067）。此结果说明当只考虑物种存在与否时，两组间菌群在整体上差异显著；而当纳入菌群的相对丰度进行评估时，两组

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