组蛋白去乙酰化酶抑制剂chidamide治疗多发性骨髓瘤溶骨性病变的机制研究

发布时间：2020-09-01 18:39

　　研究背景:多发性骨髓瘤(multiplemyeloma,MM)是造血系统来源的恶性肿瘤,以患者骨髓中恶性浆细胞克隆性增生,分泌大量单克隆免疫球蛋白和/或轻链为其特征,其发病率高居血液系统肿瘤第二位。贫血,肾功能异常,高钙血症以及溶骨性破坏是主要的临床表现,也被称为骨髓瘤相关事件。骨髓瘤溶骨性病变是MM的重要临床特征之一,约90%的患者可以出现不同程度的骨损害,导致骨骼疼痛、病理性骨折,神经压迫以及高钙血症,溶骨性病变的严重程度与MM肿瘤负荷与预后密切相关,严重影响患者的生活质量。因此,进一步研究MM及其溶骨性病变的发生机制,寻找新的治疗靶点是MM临床转化研究中亟待解决的问题。组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs)广泛表达于机体细胞,与细胞的分化发育以及肿瘤的发生发展密切相关。HDACs通过去乙酰化功能,不仅可以修饰组蛋白的乙酰化程度,调节染色质结构,抑制基因表达;同时,也可以通过去乙酰化修饰转录因子如RUNX2等,进而抑制相关下游基因的表达,从而直接或间接的参与调控的生存、增殖、分化和凋亡等过程。研究发现,HDACs在多种肿瘤中呈高表达,通过抑制抑癌基因的转录表达,阻碍正常细胞的分化成熟,促进肿瘤的发生。在多发性骨髓瘤中,HDAC3可以通过激活JAK2/STAT3通路,促进骨髓瘤细胞的增殖,提示HDACs在可能在MM发生中起到了一定作用。不仅如此,HDACs还可正向调节破骨细胞的分化成熟,同时抑制成骨细胞的功能,提示HDACs可能参与了骨髓瘤溶骨性病变的发生和发展。组蛋白去乙酰化酶抑制剂chidamide是我国自主研发的第一个口服的组蛋白去乙酰化酶亚型抑制剂,通过抑制其靶点HDAC1,2,3以及HDAC10,可以调控肿瘤异常表观遗传学,增加组蛋白乙酰化,重塑染色质,诱导多种肿瘤细胞的凋亡与周期阻滞。本文拟通过体内外实验探讨chidamide治疗骨髓瘤溶骨性病变的具体分子机制,为多发性骨髓瘤溶骨性病变的治疗提供新的观点。研究目的:1、明确chidamide对MM细胞内HDACs功能的影响以及chidamide对MM细胞体内外的杀伤作用及其具体机制。2、研究在肿瘤微环境下,chidamide对MM细胞的杀伤作用,分析chidamide对MM全身播散性小鼠模型溶骨性病变的抑制作用。3、研究chidamide对破骨细胞分化成熟的影响及其机制,分析非肿瘤情况下chidamide对RANKL诱导的小鼠急性骨损伤的保护作用。研究方法:1、利用CCK-8,流式细胞术检测chidamide对MM细胞的生长抑制作用和细胞杀伤作用。2、Western blot以及流式细胞术检测chidamide作用MM细胞后,细胞内关键蛋白表达水平变化。3、利用NOD/SCID小鼠构建人MM细胞株来源的皮下瘤小鼠模型研究chidamide的体内抗肿瘤作用。4、结合NCG小鼠构建MM播散性小鼠模型,利用小动物活体荧光成像,micro-CT,ELISA等方法研究chidamide对MM溶骨性病变的抑制作用。5、通过TRAP染色,肌动蛋白环形成实验以及钙包被板吸收形成实验研究chidamide对RANKL诱导的破骨细胞分化成熟及其功能的影响。6、构建RANKL诱导的急性骨损伤小鼠模型,利用micro-CT,ELISA等方法检测chidamide对正常小鼠的骨保护作用。研究结果:1、Western blot检测发现MM细胞株内表达chidamide靶分子HDAC1,2和HDAC3。CCK-8提示chidamide作用MM细胞48小时和72小时后可以显著抑制MM细胞株的增殖;流式细胞术提示chidamide可以诱导MM细胞凋亡,呈剂量依赖性和时间依赖性。2、Chidamide通过促进细胞内表达caspase家族蛋白,诱导MM细胞凋亡;凋亡可以被pan-caspase抑制剂Q-VD-Oph所抑制。Chidamide作用MM细胞后,western blot提示p-STAT3表达量减少,P21,P27的表达增高,CDK4.CDK6,cyclin-D2表达量下降,细胞周期检测提示细胞G1期阻滞。3、Chidamide可以抑制小鼠皮下肿瘤的生长,减轻小鼠肿瘤负荷,瘤体免疫组化提示bcl-xL,caspase3等表达下调,与细胞体外实验一致。4、Chidamide在骨髓间充质干细胞存在的条件下,仍然对MM细胞具有杀伤作用;同时chidamide可以逆转破骨细胞对MM细胞的保护作用。播散性MM小鼠模型提示chidamide不仅可以降低小鼠肿瘤负荷,还可以减轻MM相关溶骨性病变。5、体外实验提示chidamide可以抑制RANKL诱导的破骨细胞分化成熟,减轻RANKL介导的小鼠急性骨损伤。结论:1、Chidamide可以抑制MM细胞增殖,诱导MM细胞凋亡与周期阻滞。2、Chidamide可以抑制小鼠体内MM肿瘤细胞的生长,减轻小鼠肿瘤负荷,同时抑制MM溶骨性病变的发生。3、Chidamide可以抑制RANKL诱导的破骨细胞分化成熟,减轻RANKL介导的小鼠急性骨损伤。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R733.3
【部分图文】：

功能图,蛋白,功能,细胞株

浙江大学博士学位论文逦第一部分Ｃｈｉｄａｍｉｄｅ对ＭＭ细胞的体内外杀伤作用及其机制研究逡逑然后，我们我们检测了邋ｃｈｉｄａｍｉｄｅ对ＭＭ细胞株内组蛋白去乙酰化的抑制作逡逑用。Ｃｈｉｄａｍｉｄｅ以处理浓度递增的方式处理ＡＲＰ－１和ＲＰＭＩ－８２２６细胞株４８小时。逡逑＼￥６５１６0＾１0１检测发现也（＾１１１此可以显著的提高姐蛋白１＾３１０８，出１＜９以及１４４１＜：８逡逑位点的乙酰化，随着ｃｈｉｄａｍｉｄｅ浓度的升高，各位点的乙酰化程度增强，呈ｃｈｉｄａｍｉｄｅ逡逑浓度依赖性（图２．１．３）。逡逑

时间点,乙酰化,浓度依赖性,细胞株

＼￥６５１６0＾１0１检测发现也（＾１１１此可以显著的提高姐蛋白１＾３１０８，出１＜９以及１４４１＜：８逡逑位点的乙酰化，随着ｃｈｉｄａｍｉｄｅ浓度的升高，各位点的乙酰化程度增强，呈ｃｈｉｄａｍｉｄｅ逡逑浓度依赖性（图２．１．３）。逡逑ＡＲＰ－ｌ逦ＲＰＩＶ１１－８２２０逡逑Ａｃｅ－Ｈ３Ｋ１８邋逦ＷｊＴ邋＾＜１—＾逦＞逡逑Ａｃｅ－Ｈ３Ｋ９逦？「．一邋丨丨１．．１１１邋ｎＴ逦ｎ，邋一逡逑ＡＣ－Ｈ４Ｋ８逦．．．ｒ．ｘ＇丁＇丨—．＿逦ｍｍｍｍ邋■丨丨＿＿＿＿＿邋＿邋＿＿逡逑逦逦逦．…逦［｜｜｜ｉ｜｜｜｜ｉ邋ｈｉ邋＇邋ｉｎ邋１１１邋ｈｉ邋ｉｎ邋—Ｉ＂ｉ＿邋］逡逑ｃｈｉｄａｍｉｄｅ逦0邋０．７５逦１．５逦３邋｜ａＩＶＩ逦０逦１２逦４邋＼ｊ．Ｍ逡逑图２．１．３：邋Ｃｈｉｄａｍｉｄｅ抑制组蛋白去乙酰化酶功能。Ｃｈｉｄａｍｉｄｅ以处理浓度递增的逡逑方式处理ＡＲＰ－１和ＲＰＭＩ－８２２６细胞株４８小时，可以显著的提高组蛋白Ｈ３Ｋ１８，逡逑Ｈ３Ｋ９以及Ｈ４Ｋ８位点的乙酰化，呈浓度依赖性。逡逑最后，为了观察ｃｈｉｄａｍｉｄｅ是否在抑制ＭＭ细胞内ＨＤＡＣ蛋白活性的同时抑逡逑制细胞内ＨＤＡＣ蛋白的表达量，因此，我们使用不同浓度的ｃｈｉｄａｍｉｄｅ处理ＡＲＰ－１逡逑和ＲＰＭＩ－８２２６细胞株４８ｈ后检测ＨＤＡＣ１，邋ＨＤＡＣ２，邋ＨＤＡＣ３和ＨＤＡＣ１０的表达量逡逑变化。我们发现ｃｈｉｄａｍｉｄｅ基本不影响ＨＤＡＣ１，邋ＨＤＡＣ２，邋ＨＤＡＣ３和ＨＤＡＣ１０的逡逑表达量（图２．１．４）。逡逑Ｉ逡逑１９逡逑

细胞凋亡,细胞株,药物作用

图２．２．２：邋ｃｈｉｄａｍｉｄｅ诱导ＭＭ细胞凋亡，该作用可以被Ｑ－ＶＤ－Ｏｐｈ所抑制。逡逑如图所致，ｃｈｉｄａｍｉｄｅ单药作用ＡＲＰ－１和ＭＭ．ｌｓ细胞株４８ｈ后，随着药物作用浓逡逑度的增加，ＭＭ活细胞数量减少。当使用Ｑ－ＶＤ－Ｏｐｈ与ｃｈｉｄａｍｉｄｅ共同作用ＭＭ逡逑细胞株时，ｃｈｉｄａｍｉｄｅ所诱导的活细胞数明显增加。逡逑

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