MiR-20b在肝癌中表达的意义及调控HIF-1α、VEGF对肝癌细胞（HepG2）增殖及凋亡的影响

发布时间：2020-09-01 18:41

　　目的探究miR-20b在肝癌中表达水平与患者临床病理参数和预后的关系。明确miR-20b在HepG2细胞中的生物学功能,分析并验证其发挥作用的直接靶基因,探索其HepG2细胞增殖及凋亡的可能分子机制。方法 1、收集76例肝癌组织标本并且选择76例正常肝脏组织作为对照,运用RT-PCR分别检测两组miR-20b的表达水平。2、根据miR-20b在肝癌组织中的表达水平,将HCC患者分为miR-20b高表达组和低表达组,进而分析miR-20b表达量与HCC患者临床病理参数及预后之间的关系。3、利用生物学数据库检索miR-20b可能的靶基因,并通过双荧光素酶报告系统、Westernblot等技术鉴定miR-20b对其靶基因的调控。4、通过体外转染miR-20b mimic和inhibitor及siRNA-HIF-1α、siRNA-VEGF的方法,以MTT、流式细胞凋亡等检测miR-20b对HepG2细胞增殖与凋亡的影响。结果 1、分别检测了76例肝癌组织及正常肝脏组织中miR-20b的表达水平,发现在大部分肝癌组织中miR-20b表达水平明显增高,差异有显著性。2、MiR-20b表达水平与年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤分级无关,但与肿瘤转移(P=0.00)、TNM分期(P=0.00)及肿瘤复发(P=0.023)密切相关, miR-20b的高表达与肝癌患者的短总体生存期相关,提示miR-20b可以作为一个判断肝癌患者预后的独立预测因子。3、构建HIF-1α、VEGF3'-UTR pGL3cm野生型及突变型荧光素酶报告载体和pCDH-miR-20b质粒共转染HepG2细胞后。结果显示,miR-20bb可以显著下调含有HIF-1α、VEGF靶基因3’-UTR的荧光素酶报告基因pGL3-3'-UTR的活性,而对含突变位点的表达质粒对荧光素酶活性无明显改变。表明miR-20b对HIF-1α、VEGF3'-UTR有直接负转录调控作用。4、MiR-20b与HIF-1α、VEGF在HepG2细胞正常或模拟低氧条件表达水平呈现相反趋势。在常氧条件下,miR-20b的表达与低氧组(低氧组细胞使用300μmol/L CoCl2处理细胞24h)相比明显增高,具有统计学意义。低氧条件下VEGF的mRNA表达水平与常氧组相比明显增高,差异具有统计学意义。HIF-1α的mRNA表达水平增加并不明显。5、MiR-20b的高表达能够明显增加HepG2细胞的增殖能力。当抑制miR-20b细胞增殖能力下降。同时沉默HIF-la、VEGF功能后细胞增殖能力随之增强。HIF-la、VEGF在常氧环境中对于细胞增殖起着决定性作用。6、在常氧环境下细胞抑制miR-20b能够明显的降低细胞凋亡比率。同时沉默HIF-la、 VEGF功能后细胞凋亡比率明显增加。低氧环境下细胞转染miR-20b-mimics后发现细胞凋亡明显增加,HIF-1α、VEGF的表达对减少细胞凋亡起着决定性作用。结论 1、与正常肝脏组织相比miR-20b在人肝癌组织中高表达,提示miR-20b的高表达与肝癌的发展、转移及复发具有密切相关。2、肝癌组织中miR-20b的表达水平与肝癌患者的临床病理参数及总体生存期相关,暗示miR-20b的表达量可以作为判断肝癌患者预后的一个潜在的预测指标。3. HIF-1α、VEGF为miR-20b直接靶基因,miR-20b对HIF-1α、VEGF3'-UTR有直接负转录调控作用。4、正常环境中miR-20b高表达而调控HIF-1α、VEGF的表达；当细胞处于低氧环境下由于HIF-1α、VEGF的高表达反过来调控miR-20b的表达。5、miR-20b和HIF-1α、VEGF在不同环境中相互调控影响细胞的增殖及细胞抗凋亡的能力。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R735.7
【部分图文】：