酸性微环境对单核-巨噬细胞、Tca8113细胞的影响及雷公藤甲素在其中的作用

发布时间：2020-09-03 09:41

　　目的:肿瘤细胞在利用周围环境增殖的同时,也在改变其生长的微环境,使细胞外呈现酸性,间质细胞中单核-巨噬细胞受微环境的变化而影响其表型分化及功能状态,更多的参与了肿瘤的生长和转移。本研究模拟肿瘤细胞外酸性微环境,了解酸性微环境下Tca8113细胞增殖及分泌细胞因子等生物学行为的变化、酸性微环境对巨噬细胞表型分化及功能状态的影响及雷公藤甲素(TP)在此过程中的干预效果,进一步了解肿瘤发生、发展、转移及肿瘤细胞抵御治疗的机制,也为抗肿瘤药物的研发提供新的思路和理论基础。方法:1、通过10%HCl调整细胞培养液的p H值分别为7.2、7.0、6.8、6.6下进行64h Tca8113细胞的培养,ELISA法测定培养液中的白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)和低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)的含量,MTS法测定Tca8113细胞增殖情况;2、流式细胞仪分离人外周血单核细胞,通过10%HCl调整细胞培养液的p H值分别为7.2、7.0、6.8、6.6,分别单独培养及与Tca8113细胞混合培养,培养时间为经预实验确定的64h,流式细胞学检测细胞表面CD68分子、CDl63分子和CD80分子的表达以进行巨噬细胞分型,其中CD68分子标记巨噬细胞,CD80标记M1型巨噬细胞,CD163分子标记M2型巨噬细胞;ELISA法测定培养液中的白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)、白细胞介素-12(interleukin-12,IL-12)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的含量;上述培养液采用MTS法检测对淋巴细胞转化的作用;不同p H值下混合培养MTS法测定Tca8113细胞的增殖。3、通过10%HCl调整单核-巨噬细胞系THP-1细胞培养液的p H值分别为7.2、6.8、6.6,进行24h、48h、72h的培养,分别加入不同浓度TP,ELISA法检测培养液中VEGF和血管内皮生长因子-C(vascular endothelial growth factor,VEGF-C)的含量;4、提取人外周血单核细胞,调整细胞培养液的p H值分别为7.2、7.0、6.8、6.6,加入不同浓度的TP,培养64h,流式细胞学检测细胞表面CD68分子、CDl63分子和CD80分子的阳性及阴性以进行单核-巨噬细胞分型,ELISA法测定培养液中的IL-10、IL-12的含量,收集上述培养液采用MTS法检测对淋巴细胞转化的作用;在单核-巨噬细胞与Tca8113细胞混合培养液中加入上述不同浓度的TP,MTS法测定Tca8113细胞增殖情况,设Tca8113细胞加入不同浓度TP作为对照。结果:1、p H值为7.2、7.0、6.8、6.6时,Tca-8113细胞OD值分别为2.722±0.039、2.828±0.048、2.884±0.010、2.896±0.022,各组间有显著性差异(P0.05),培养液中IL-8含量分别为192.8±3.5、205.9±0.7、208.6±0.5、216.4±3.9ng/L,各组间有显著性差异(P0.05),MCP-1含量分别为33.74±0.27、33.82±0.41、34.07±0.41、34.77±0.45ng/L,差异有显著性(P0.05),HIF-1含量分别为36.63±0.11、37.78±1.05、37.71±0.74、128.90±2.97ng/L,各组间有显著性差异(P0.05)。2、单核-巨噬细胞单独培养组中,p H值为7.2、7.0、6.8、6.6时,CD68+单核-巨噬细胞分别为97.65%、97.50%、97.09%、98.84%,差异没有显著性(P0.01);CD68+CD163+单核-巨噬细胞(M2型巨噬细胞)分别为2.61%、2.73%、2.71%、6.40%,其中p H值6.6时高于p H值7.2、7.0、6.8时,差异有显著性(P0.01);CD68+CD80+单核-巨噬细胞(M1型巨噬细胞)分别为3.77%、6.60%、5.82%、17.74%,其中p H值6.6时高于p H值7.2、7.0、6.8时,差异有显著性(P0.01);培养液中代表M2型巨噬细胞分泌的IL-10含量分别为37.26±0.17、37.22±0.17、38.57±1.50、39.63±0.83ng/L,差异有显著性(P0.05);VEGF分别为103.0±1.2、102.5±0.5、106.5±2.1、110.3±4.8pg/L,差异有显著性(P0.05);培养液中代表M1巨噬细胞分泌的IL-12含量分别为5.939±0.024、5.925±0.048、5.884±0.024、5.842±0.048ng/L,差异有显著性(P0.05)。单核-巨噬细胞与肿瘤细胞混合培养组中,p H值为7.2、7.0、6.8、6.6时,CD68+单核-巨噬细胞分别为98.00%、95.66%、97.07%、99.37%,p H值6.6时与p H值7.0时差异有显著性(P0.01),相同p H值时与单独单核-巨噬细胞培养组差异没有显著性(P0.01);CD68+CD163+单核-巨噬细胞(M2型巨噬细胞)分别为1.81%、2.94%、3.46%、5.67%,其中p H值6.8时与p H值7.2、7.0时比较及p H值6.6时与其它p H值时比较,差异有显著性(P0.01),p H6.8时其比率高于而p H6.6低于单独单核-巨噬细胞培养组,差异有显著性(P0.01);CD68+CD80+单核-巨噬细胞(M1型巨噬细胞)分别为5.88%、10.10%、10.72%、14.09%,差异有显著性(P0.01),p H7.0、6.8时其比率高于而p H6.6低于单独单核-巨噬细胞培养组,差异有显著性(P0.01);培养液中代表M2型巨噬细胞分泌的IL-10含量分别为37.10±0.55、37.34±0.55、54.63±0.41、56.16±0.93ng/L,差异有显著性差异(P0.05);VEGF分别为171.7±0.9、173.3±1.2、173.0±0.8、177.4±2.5pg/L,差异有显著性(P0.05),培养液中代表M1巨噬细胞分泌的IL-12含量分别为9.703±0.080、9.730±0.023、9.556±0.129、9.490±0.122ng/L,差异有显著性(P0.05)。3、在相同p H值时随着TP浓度的增加THP-1细胞培养液中VEGF、VEGF-C含量减少,差异有显著性(p0.05),p H值6.6及TP浓度50ug/ml时最低(p0.05)。4、酸性微环境下经TP干预后,与不加TP相比,加入不同浓度TP后M1型巨噬细胞比率增加,而且随TP浓度上升比率增加,差异有显著性(p0.01),TP在较低浓度(10-25μg/ml)M2型巨噬细胞比率有增加,差异有显著性(p0.01),在较高浓度50-100μg/ml时M2型巨噬细胞比率明显减少,差异有显著性(p0.01);析因方差分析显示,在不同p H值下随TP浓度的增加细胞培养液中IL-10的含量均出现减少(p0.01),而IL-12含量随TP浓度的增加均出现增加(p0.01),TP浓度为50μg/ml、100μg/ml时细胞培养液中IL-12较TP浓度为10μg/ml、25μg/ml时增加明显(p0.05);不同p H值时加入不同浓度的TP的细胞培养液明显增加了淋巴细胞的转化,并随浓度的上升作用增强(p0.05)。单独应用TP在低浓度时(10μg/ml和25μg/ml)Tca8113细胞数量有增加,而在高浓度(50μg/ml和100μg/ml)时Tca8113细胞数量明显减少(p0.05);与单核-巨噬细胞联合加入不同浓度的TP均使Tca8113细胞数量明显减少,且随浓度增加而减少明显(p0.05)。结论:1、Tca8113细胞能够通过自身的改变更好的适应酸性微环境,上调多种对单核-巨噬细胞具有趋化作用的因子,Tca8113细胞能够作为研究酸性微环境对肿瘤细胞及非肿瘤细胞影响的研究对象;2、酸性微环境可以使单核细胞向M1和M2型巨噬细胞两极分化,但表现为M2型巨噬细胞的功能状态,从而更多的促进肿瘤细胞的生长,酸性微环境可能是肿瘤内浸润的巨噬细胞出现促瘤作用的直接因素之一;3、在酸性微环境下,低浓度TP就能促使单核细胞更多的向M1型巨噬细胞转化,并表现为M1型巨噬细胞的功能状态,产生明显的抑制肿瘤细胞增殖的作用,TP可以作为以肿瘤内浸润的巨噬细胞为靶点的抗肿瘤药物研发的研究方向,但其机制及如何有效利用TP调节单核-巨噬细胞分化及功能状态而达到抗肿瘤的目的还需要更多的研究。
【学位单位】：贵阳医学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R730.2

【参考文献】