循环肿瘤细胞的在体无创实时监测研究

发布时间：2020-09-07 14:30

　　 肿瘤因其发病率高、死亡率高成为威胁人类健康的最大疾病。肿瘤发生时多为器官局限性疾病,但最终几乎都会通过血液或淋巴传播到远处器官形成转移。大多数肿瘤患者死于转移性肿瘤,而非原发性肿瘤,肿瘤的转移成为导致肿瘤患者死亡的主要原因。循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell,CTC)作为肿瘤转移标志越来越受到重视,CTC的数目可以用来评估肿瘤转移的进程,也可以作为肿瘤患者的预后判断、化疗药物的快速评估、肿瘤复发等的重要指标。目前CTC检测技术多为体外检测,依赖采血。主要是利用循环肿瘤细胞的形态学特征、免疫学特征以及流式细胞技术等原理来捕获CTC。目前的这些方法均存在着复杂的样品制备和采集过程,在这个过程中容易造成细胞的污染、漏检、假阳性等一系列的问题,且受到抽血量的影响,检测灵敏度受限,难以频繁采血实现动态监测,比如在肿瘤化疗疗程进行中的疗效评估等。为了解决现有离体检测CTC技术中存在的问题,本论文进行了针对CTC在体无创实时监测的研究。该CTC在体检测技术结合了实时高速荧光影像技术以及流式细胞检测的概念来获取实时、高信噪比的肿瘤细胞信号来动态监测活体(小动物或人体)血循环内某个(某些)靶细胞群体的存在,如实体瘤血液播散后在血循环中的转移性肿瘤细胞,并进行定量分析。由于无需抽血,该技术能有效避免现有体外检测技术由抽血所引起的细胞污染、漏检、假阳性等问题,同时可以对同一实验个体进行长时间的监测,从而提高了检测灵敏度。因此,该技术不仅实现了实时动态无损监测CTC,而且有助于我们理解肿瘤的发生、发展的过程以及发生转移的分子机制,为肿瘤转移的基础研究和诊断治疗提供一个新的技术手段。首先,论文在单一激光波长活体流式细胞仪的基础上,利用激光共聚焦的原理将不同波长的激光聚焦到同一平面上,研制了基于荧光标记的多波长活体流式细胞仪。我们利用基于荧光标记的多波长活体流式细胞仪通过对小鼠前列腺癌皮下肿瘤模型和原位肿瘤模型中CTC数量、肿瘤体积以及存活率的监测,发现了原位肿瘤模型循环系统中的CTC数量远高于皮下肿瘤模型循环系统中的CTC的数量,且成爆发式增长,皮下肿瘤模型循环系统内CTC的数量呈渐进式增长,肿瘤的体积也呈渐进式增长;皮下肿瘤模型小鼠的存活率也高于原位肿瘤模型小鼠。该研究结果从一定程度上解释了肿瘤生长微环境对肿瘤血源性转移造成的影响;同时发现原位肿瘤模型的肿瘤进展状况接近于临床表现,表明原位肿瘤模型更适合研究肿瘤的转移。以上基于荧光标记的活体流式细胞仪虽然为CTC的检测提供了一个有力工具,但是由于其检测还依赖于将肿瘤细胞进行体外荧光标记后注入体内,或在体内进行荧光标记,目前该技术仅局限于实验室动物研究,难以应用于临床。为了解决活体检测荧光标记的问题,我们进一步研究开发了基于光声效应的无标记活体流式细胞仪。本研究利用黑色素瘤细胞和血液背景在近红外波段具有显著的吸收差异即光声信号的差异,以及近红外光/声信号在组织中的较小吸收/散射的特点,实现高灵敏、较大穿透深度的无标记活体检测。首先,我们对黑色素瘤细胞产生光声信号的边界条件进行了理论计算,并根据计算结果确定了激发光源的各项参数,通过对黑色素瘤细胞产生光声信号的特点进行理论计算和分析,根据其特征确定了光声信号接收装置的参数,并对测得的细胞光声信号用小波去噪和平均去噪方法进行去噪处理及数据分析,发展了基于光声效应的无标记活体流式细胞仪。在此基础上,我们利用黑色素瘤小鼠模型对活体小鼠体内循环黑色素瘤细胞进行了无标记、实时、动态监测实验。根据实验数据,我们总结了小鼠体内的CTC随着时间的推移其数量在不断增加,同时发现原发性肿瘤附近的动脉比远端动脉具有更高的检测效率。该结果证明了基于光声效应的无标记活体流式细胞仪可以实现对循环系统内黑色素瘤细胞的无标记检测。本研究使用CTC无标记光学定量检测,将黑色素瘤循环肿瘤细胞的光声信号作为活体流式细胞仪的检测信号,从而实现CTC无标记、在体、实时、动态监测,为有效解决活体流式细胞仪检测技术应用于临床所面临的最大问题提供了一种切实可行的办法。虽然以上基于光声效应的活体流式细胞仪对小鼠循环系统内黑色素瘤细胞的监测结果证明了该技术进行在体无标记检测的可行性,但是由于前期的研究仍是以动物为研究对象,在很多方面与临床应用仍有一定的差异。首先,在光学系统的设计上,临床应用对光路的稳定性、小型化、便携性等要求更高。其次,在动物实验平台所采用的对待测血管进行图像导航以便精准定位的方法受人体皮肤较厚的影响在临床上无法对人体待测血管进行精准定位。第三,在临床应用中,人体循环系统的血流速度、血管大小等和动物均有着一定的差异。最后临床系统中所采用激光要必须满足临床安全要求。因此为了将活体无标记检测技术应用于临床,我们首先对基于光声效应的无标记活体流式细胞仪的光路进行微型化设计,我们采用微型双弯月透镜组和双胶合透镜组对激光光斑进行整形聚焦,设计了适合人体腕部佩戴的光声监测手环,从而形成一个可以佩戴在人体腕部,能对腕部血循环系统内的黑色素瘤细胞进行动态监测的可穿戴设备。其次,我们通过激光倍频技术将1064 nm波长的激发光进行倍频产生532 nm波长的激光,利用皮肤和血管被532 nm波长激光所照射产生超声信号的差异性,设计了信号导航系统,从而实现了对人体腕部待测血管的精准定位。最后,我们通过对人体的血管直径、血流速度、激光安全要求等参数进行理论计算与分析,最终确定了设备各个器件的技术指标,并利用该仪器对静态组织黑色素以及体外悬浮黑色素瘤细胞的光声信号进行了检测;实验结果初步验证了系统设计的合理性、参数选择的科学性以及配套软件的实用性。设备的应用有望在临床上实现早期在体实时监测人体循环系统中的黑色素瘤细胞,在帮助医生评估黑色素瘤转移状况,对黑色素瘤患者进行个体化疗效动态评估以及监测肿瘤的复发等领域具有很好的应用前景。
【学位单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R730.4
【部分图文】：

文 于肿瘤等疾病的早期诊断和血细胞的免疫及肿瘤治疗疗效进行评估提供了一种新的突绍该技术的原理、国内外研究现状，设计胞仪，进一步扩展仪器的应用范围，为癌基于荧光标记的三通道活体流式细胞仪对进行监测，研究皮下肿瘤模型和原位肿瘤量之间的相关性及其机制分析。记的活体流式细胞仪国内外研究现状佛医学院Charles P. Lin等人首次报道了一Vivo Flow Cytometry，IVFC）[99]，图 2-1 细胞仪的基本原理图。

分析 CTC 转移的机理。记的多波长活体流式细胞仪的研制的活体流式细胞仪可以解决活体血管内快速时、动态、长时间的监测循环系统中的荧光标活体流式细胞仪的原理图：激发光源通过光斑通过显微镜镜头聚焦在活体表浅的适当血的靶细胞（如 CTC）通过激光在该血管的聚定波长的荧光信号，其发出的荧光信号被荧转换器（PMT）后光信号转换成电信号，电信得到单位时间（比如每分钟）通过该视窗的

图 2-3 基于荧光标记的多波长活体流式细胞仪整体结构原理图A-激光激发系统；B-图像导航系统；C-荧光信号接收与分析系统Figure 2-3 Fluorescent labeling based on the overall structure of the in vivo flow cytometeschematic；A-Laser excitation system；B-Image navigation system；C-Fluorescent signal receptiand analysis system激光激发系统：激发光路系统是为整个活体流式细胞仪提供激发光源，主要包括：488 nm 波长激光器、561 nm 波长激光器、635 nm 波长激光器，反射镜片柱透镜、消色差透镜、物镜等组成。激光激发系统设计工作原理为：561nm 波长激光器、488nm 激光器和 635n波长激光器分别经反射镜（M1）、分光镜（M2）和分光镜（M3）反射到同一直线上，然后经柱透镜（CL）将激光的圆形光斑压缩成条形光斑，从柱透镜出的条形光斑经过消色差透镜进行消色差优化处理，光束通过分光镜（DM3）反射进入物镜，物镜将光斑进行聚焦，最终形成一个约为 5×100 微米的一个条形光斑该光斑可以有效覆盖小动物（小鼠）耳部血管形成激光视窗，当循环系统中有荧

【参考文献】

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1 李延;樊志超;郭进;刘光大;谭晓英;王成;顾正勤;魏勋斌;;Circulation times of hepatocellular carcinoma cells by in vivo flow cytometry[J];Chinese Optics Letters;2010年10期

本文编号：2813469