弥漫大B细胞淋巴瘤来源外泌体介导肿瘤免疫中的双向调节作用研究

发布时间：2020-09-11 10:59

　　研究背景:弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)是成人非霍奇金淋巴瘤中最常见的一种类型。DLBCL属于高度侵袭性淋巴瘤,发病后肿瘤能迅速转移到淋巴结、脾脏、肝脏、骨髓及其他脏器。对于DLBCL的治疗,CHOP已经成为标准一线化疗方案,再联合CD20单抗的治疗方案显著提高了 DLBCL患者的生存率,但是由于DLBCL异质性大,仍有近三分之一的DLBCL患者产生复发或耐药。目前,旨在提高患者自体免疫功能以发挥更强抗肿瘤作用的免疫治疗已成为研究热点。相对传统的化疗、放疗,免疫治疗具有更轻副毒作用的优势。免疫治疗中的DC(Dendric cell,DC)疫苗,即以肿瘤抗原激活DC诱导特异性免疫应答,其治疗效果已得到了临床验证,但因刺激DC的肿瘤抗原免疫原性较弱等原因还不能完全发挥其抗肿瘤作用优势。因此我们迫切希望寻找到一种与疾病相关的特异性抗原,能体现DLBCL不同亚型疾病的特征,进而能引起更强的免疫应答及靶向治疗作用,提高DLBCL缓解率。外泌体(exosome,EXO)是多种细胞类型包括肿瘤细胞和造血细胞在内的细胞都能分泌的一种纳米级囊泡,尤其肿瘤细胞分泌量更大。外泌体携带其来源细胞及肿瘤微环境的独有特征,参与了免疫抑制调节、肿瘤血管新生及转移、抗肿瘤作用等多种生物过程。携带疾病独有生物学特征的外泌体作为激活DC的肿瘤抗原有望更精准地诱导抗肿瘤作用。然而,关于DLBCL EXOs的生物学特征及在肿瘤免疫中发挥的作用仍不明晰,有待进一步研究。研究目的:研究DLBCL细胞分泌的外泌体特有的生物学特征,及在肿瘤免疫中发挥的多方面作用,为DLBCL的免疫治疗探索一种新的治疗模式。研究方法:(1)WB法、流式细胞仪、电镜、NTA检测、蛋白芯片、MicroRNA芯片检测DLBCL EXOs的生物学特征,与Burkitt淋巴瘤细胞外泌体进行比较区分独有特征。(2)PKH67染色法检测DLBCL EXOs被DC和肿瘤细胞摄取情况。(3)流式细胞仪检测DLBCL EXOs作用后的受体细胞蛋白表达变化。(4)MTT法检测DLBCL EXOs作用后基质细胞增殖情况。(5)划痕实验检测DLBCL EXOs作用后HUVEC迁移情况。(6)Transwell侵袭实验检测DLBCL EXOs作用后的基质细胞侵袭情况,WB和PCR分析侵袭相关蛋白变化。(7)体内外基质胶实验检测DLBCL EXOs作用后血管新生情况(8)DLBCL EXOs荷瘤小鼠实验检测DLBCL EXOs对肿瘤生长情况影响。(9)DLBCL EXOs负载DC后,CFSE染色法、流式细胞仪检测DLBCL EXOs对T细胞功能影响情况。(10)肿瘤细胞来源外泌体(Tumorderived exosomes,TEXs)免疫后小鼠,在肿瘤负荷下,流式细胞仪、LDH细胞毒性实验检测外泌体的抗肿瘤作用。研究结果:(1)DLBCL 细胞分泌的 EXOs 表达 c-myc、Bcl-2、Mcl-1、CD19、CD20 等特征性抗原,与同属B细胞淋巴瘤的Raji细胞分泌的EXOs相比,具有明显不同的特征。(2)DLBCL EXOs能被DC和淋巴瘤细胞轻易摄取,并呈时间依赖性。(3)DLBCL EXOs能转运分子到其他受体细胞。(4)DLBCL EXOs诱导Th2细胞凋亡,上调Th2细胞PD-1表达,表明DLBCL EXO s可引起免疫抑制作用。(5)DLBCL EXOs能促进基质细胞增殖、迁移、侵袭、血管新生。(6)DLBCL EXOs小鼠荷瘤实验结果表明,DLBCL EXOs在体内促进肿瘤生长。(7)流式检测DLBCL EXOs不能诱导DC凋亡。(8)DLBCL EXOs激活DC后,与T细胞共培养,发现能刺激T细胞增殖,上调细胞因子IL-6和TNFα,下调抑制性细胞因子IL-4和IL-10。(9)TEXs免疫小鼠后,再遇肿瘤细胞攻击后能发挥抗肿瘤作用。研究结论:(1)DLBCL EXOs携带特征性的肿瘤抗原,能被DC和肿瘤细胞摄取并能转运分子到其他受体细胞。(2)DLBCL EXOs能促进基质细胞增殖、迁移、侵袭、血管新生并对Th2细胞起到一定程度的免疫抑制作用。(3)DLBCL EXOs作为抗原激活DC后,与T细胞共培养能促进T细胞功能。TEXs免疫小鼠后在肿瘤负荷下能起到抗肿瘤作用。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R733.1
【部分图文】：

沉淀法,负染

图１．１．１邋ＰＥＧ沉淀法提取的Ａ２０邋ＥＸＯｓ逡逑（Ａ．负染观察的外泌体（Ｘ８００００）；邋Ｂ？Ｄ．切片观察的外泌体；Ｂ邋（Ｘ１１５００）、（Ｘ２０５００），邋Ｄ邋（Ｘ４４０００））逡逑．３．１．２邋ＰＥＧ沉淀法提取的外泌体的标志性蛋白特征逡逑为了验证ＰＥＧ沉淀法提取的外泌体是否具有外泌体该有的标志性特征，我用ＷＢ法来具体分析外泌体携带的蛋白成分。从ＷＢ结果来看，ＰＥＧ沉淀法的外泌体均能检测到外泌体中标志性蛋白四跨膜家族成员ＣＤ６３、ＣＤ８１的表休克蛋白ＨＳＰ－７０、ＧＡＰＤＨ都有少量表达，且没有表达细胞株中富含的胞浆Ｃｙｔｏ－Ｃ。提示外泌体能表达来源细胞的一些特征如携带ＨＳＰ－７０、ＧＡＰＤＨ等。电镜及ＷＢ研究结果都表明了邋ＰＥＧ沉淀法提取的外泌体都符合外泌体的经征。详见图１．１．２。逡逑

沉淀法,蛋白,蛋白分布,细胞株

１．１．２邋ＰＥＧ沉淀法提取的Ａ２０邋ＥＸＯｓ表达特征性蛋白逡逑淀法提取的外泌体中的蛋白分布特点逡逑泌体通过１０％浓度ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分离后再经考马斯图。如图１．１．３．１可以明显看出，细胞株本身含的蛋白外泌体大部分蛋白集中分布在５５？１３０ＫＤ。值得注意的丰富的区域。所以我们再次使用ＰＥＧ沉淀分离提取可能存在的外泌体进行对比，果然同样观察到了类似的沉淀可能存在血清蛋白的污染。这与ＰＥＧ沉淀法的原理提高了外泌体的产量，但是也增加了其他蛋白污染的可养基１６４０和ＩＭＤＭ的泳道能观察到类似的蛋白分布。淀的ＳＵ－ＤＨＬ－１６ＥＸＯＳ，与ＳＵ－ＤＨＬ１６细胞株全蛋白的发现竟然没有检测到跨膜四分子蛋白ＣＤ８１、ＣＤ６３表

蛋白分布,沉淀法,试剂盒

１．１．３．２邋ＰＥＧ沉淀法提取的基础培养基ＥＸＯｓ和ＳＵ－ＤＨＬ－１６邋ＥＸＯｓ的蛋白表．３．２邋ｅｘｏＥａｓｙ试剂盒提取外、泌体及鉴定逡逑３．２．１邋ｅｘｏＥａｓｙ试剂盒提取外说体形态学观察逡逑为进一步优化外泌体的提取方法，我们又尝试了一种同样简便易行的方ｅｘｏＥａｓｙ试剂盒提取外泌体。从电镜结果看，ｅｘｏＥａｓｙ试剂盒提取的外泌体不观察到典型的膜状结构，平均粒径偏小。如图１．２．１Ｃ－Ｄ背景较脏，杂质较多，逡逑野不清晰，可见片状的聚合物。详见图１．２．１。逡逑２０逡逑

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