LncNONHSAT028712影响乳腺癌细胞增殖作用的研究
发布时间：2020-09-14 19:03
【摘要】：乳腺癌是现今危害女性健康的主要原因之一,其机理复杂,迄今尚未明确。非编码RNA(ncRNA)是表观遗传修饰的一种,其较编码基因具有更广泛的调控网络和调控机制,是如今肿瘤机制研究的一个热点话题。ncRNA根据其长度有可分为短ncRNA和长ncRNA(LncRNA)。LncRNAs表达水平比蛋白质编码基因低,但其表达具细胞/组织特异性,涉及多种生理和病理过程。本课题主要研究LncRNA在乳腺癌细胞增殖中的作用。本课题首先通过高通量测序,遴选在良性和恶性乳腺癌细胞中差异表达的LncRNAs,筛选出了尚未报道过的LncNONHSAT028712(简称Lnc712)。并且通过荧光定量PCR进一步验证了这一基因在乳腺癌细胞中的表达高于人非致瘤性细胞。随后通过转染LncRNA Smart Silencer干扰以及流式细胞实验的方法分析了Lnc712在乳腺癌细胞中的生物学功能,发现转染LncRNA Smart Silencer敲低Lnc712的表达后,乳腺癌细胞的存活率下降,并且细胞停滞在G1期,而不进入S期,导致细胞周期被破坏,细胞的增殖受到限制。实验结果随后显示细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases,CDK2)在mRNA水平和蛋白水平的表达均随Lnc712的敲低而降低,提示Lnc712可以通过调节CDK2的表达来调控细胞周期的进程。基于上述的推论,进一步研究了Lnc712调控CDK2的机制。首先用RNA pull down实验和质谱实验分析并筛选出了与Lnc712直接结合的蛋白HSP90,并通过蛋白免疫印迹再次验证了两者之间的结合。随后荧光定量PCR和蛋白免疫印迹实验结果显示CDK2在mRNA水平和蛋白水平的表达均随HSP90的敲低而降低,说明HSP90可以调控CDK2的表达。通过查阅已有的文献报道发现,HSP90与Cdc37形成的复合物HSP90/Cdc37可以调节下游CDK2的稳定性。免疫共沉淀结果显示,在乳腺癌细胞中沉默Lnc712表达后,HSP90与Cdc37的结合被破坏。提示Lnc712可能通过破坏HSP90/Cdc37复合物的形成调节CDK2的表达。综上所述,本课题首先筛选出了在乳腺癌细胞中异常高表达的Lnc712,进一步实验又验证了Lnc712可以通过调控HSP90与其辅助分子伴侣Cdc37的结合,调节下游CDK2的表达,从而调控细胞周期,影响乳腺癌细胞的增殖。因为细胞的无限制增殖是肿瘤发生发展的一个重要因素,所以本课题的发现有望为寻找肿瘤治疗的新靶点提供可能方向,值得进一步的研究和探索。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9
【图文】：
细胞周期能否顺利启动的关键点在于 G1 期，细胞能否殖的关键点。G1 期相关调节因子有 CyclinD、CyclinE、CD 聚集出现在 G1 晚期，与 CDK4 相结合，形成 CyclinD/C合位点附近的一个保守苏氨酸被磷酸化后，其酶活性达到 G高点时，视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）磷酸化，然后释放与E2F 进而促进 CyclinE 与 CDK2 结合成 CyclinE/CDK合物经过磷酸化修饰后，又可反过来抑制 pRb 的表达，进一 DHFR、polⅡ等多种与 DNA 复制相关的基因表达，使细进入 S 期后，CyclinE 被泛素化降解，CDK2 随后又与 CyA 的复制。G2 期主要由 CDK1 先后形成的复合物 Cycli行调节，其中起主要作用的是 CyclinB/CDK1，它与细胞成被称为成熟促进因子(MPF)，MPF 可通过磷酸化修饰多种与如核层连蛋白、组蛋白、微管蛋白等。M 期是细胞周期中的末期被泛素化降解，有丝分裂终止[51, 53-56]。
图 1-2 HSP90 构象循环Fig.1-2 HSP90 conformation cycle辅助分子伴侣相互作用，一同维持细胞内的稳态。HSP90，然后允许具有酶活性的其他辅助分子伴侣折叠或修复辅助分子伴侣分为两类：一类是通过四分体肽（TPR）结为不需要 TPR 结构域而与 HSP90 结合的。大部分为第P90 中发现的 MEEVD 基序以及 Hsp70 中的 EEVD 基序[70-相互作用蛋白（CHIP），Hsp70-相互作用蛋白（HIP），，蛋白磷酸酶 5（PP5）和几种具有肽基-脯氨酰异构酶（FK506 结合蛋白，肽基脯氨酰异构酶 D（PPID）/亲环蛋白 Tom7046 等[71]。不需要 TPR 结构域即可与 HSP90 结合CDC37），HSP90 ATPase（Aha）1 和 p23 的激活剂[88,HSP90 ATP 酶活性，影响下游蛋白的新陈代谢。因此，药物靶标[90]。大量研究表明在不同核苷酸和辅助伴侣存在构象也不相同。研究人员根据大量研究数据提出了 HSP9
第三章 实验结果与讨论 Lnc712 在乳腺癌细胞中高表达1 微阵列分析筛选乳腺癌细胞中差异表达的 LncRNAs对良性乳腺癌细胞株 MCF-7/WT 和恶性乳腺癌细胞株 MCF-7/ADM 进行表达列分析（包括编码、非编码 RNA），分析 LncRNAs 在这两株细胞中的表达情出在这两株细胞中表达有差异的 LncRNAs。分析结果如图 3-1 所示，图 A 中表示在两株细胞中表达具统计学差异的基因。图 B 中红色的表示表达量高的基的表示表达量较低的。通过相关数据对比发现，在 MCF-7/ADM 细胞中，有ncRNA 和未标注的转录物上调，3708 个下调（图 3-1 A），而有 3423 个 mRN2950 个下调（图 3-1 B，倍数变化≥ 2，P < 0.05）。在这 4030 个基因中，Lnc712 在两株细胞中的差异性是较为显著的，该基F-7/ADM 中高表达，在 MCF-7/WT 中低表达，说明 Lnc712 在乳腺癌恶性肿瘤表达相较于良性乳腺癌细胞中高。
本文编号：2818546
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9
【图文】：
细胞周期能否顺利启动的关键点在于 G1 期，细胞能否殖的关键点。G1 期相关调节因子有 CyclinD、CyclinE、CD 聚集出现在 G1 晚期，与 CDK4 相结合，形成 CyclinD/C合位点附近的一个保守苏氨酸被磷酸化后，其酶活性达到 G高点时，视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）磷酸化，然后释放与E2F 进而促进 CyclinE 与 CDK2 结合成 CyclinE/CDK合物经过磷酸化修饰后，又可反过来抑制 pRb 的表达，进一 DHFR、polⅡ等多种与 DNA 复制相关的基因表达，使细进入 S 期后，CyclinE 被泛素化降解，CDK2 随后又与 CyA 的复制。G2 期主要由 CDK1 先后形成的复合物 Cycli行调节，其中起主要作用的是 CyclinB/CDK1，它与细胞成被称为成熟促进因子(MPF)，MPF 可通过磷酸化修饰多种与如核层连蛋白、组蛋白、微管蛋白等。M 期是细胞周期中的末期被泛素化降解，有丝分裂终止[51, 53-56]。
图 1-2 HSP90 构象循环Fig.1-2 HSP90 conformation cycle辅助分子伴侣相互作用，一同维持细胞内的稳态。HSP90，然后允许具有酶活性的其他辅助分子伴侣折叠或修复辅助分子伴侣分为两类：一类是通过四分体肽（TPR）结为不需要 TPR 结构域而与 HSP90 结合的。大部分为第P90 中发现的 MEEVD 基序以及 Hsp70 中的 EEVD 基序[70-相互作用蛋白（CHIP），Hsp70-相互作用蛋白（HIP），，蛋白磷酸酶 5（PP5）和几种具有肽基-脯氨酰异构酶（FK506 结合蛋白，肽基脯氨酰异构酶 D（PPID）/亲环蛋白 Tom7046 等[71]。不需要 TPR 结构域即可与 HSP90 结合CDC37），HSP90 ATPase（Aha）1 和 p23 的激活剂[88,HSP90 ATP 酶活性，影响下游蛋白的新陈代谢。因此，药物靶标[90]。大量研究表明在不同核苷酸和辅助伴侣存在构象也不相同。研究人员根据大量研究数据提出了 HSP9
第三章 实验结果与讨论 Lnc712 在乳腺癌细胞中高表达1 微阵列分析筛选乳腺癌细胞中差异表达的 LncRNAs对良性乳腺癌细胞株 MCF-7/WT 和恶性乳腺癌细胞株 MCF-7/ADM 进行表达列分析（包括编码、非编码 RNA），分析 LncRNAs 在这两株细胞中的表达情出在这两株细胞中表达有差异的 LncRNAs。分析结果如图 3-1 所示，图 A 中表示在两株细胞中表达具统计学差异的基因。图 B 中红色的表示表达量高的基的表示表达量较低的。通过相关数据对比发现，在 MCF-7/ADM 细胞中，有ncRNA 和未标注的转录物上调，3708 个下调（图 3-1 A），而有 3423 个 mRN2950 个下调（图 3-1 B，倍数变化≥ 2，P < 0.05）。在这 4030 个基因中，Lnc712 在两株细胞中的差异性是较为显著的，该基F-7/ADM 中高表达，在 MCF-7/WT 中低表达，说明 Lnc712 在乳腺癌恶性肿瘤表达相较于良性乳腺癌细胞中高。
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前7条
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2 齐力旺;Xinmin Li;张守攻;安道昌;;非编码蛋白RNA的遗传调控[J];中国科学C辑:生命科学;2006年03期
3 高燕,林莉萍,丁健;细胞周期调控的研究进展[J];生命科学;2005年04期
4 庞月华,张新平,冯义伯,何善述;细胞周期及其调控研究进展[J];新疆医科大学学报;2005年06期
5 韩宇萍;细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂:一类全新的抗肿瘤药物[J];中国药房;2004年06期
6 王雪玲;细胞周期调控蛋白的生物学功能[J];生物学教学;2003年07期
7 袁碧波;细胞增殖周期各类调控因子研究进展[J];国外医学.妇产科学分册;1998年02期
本文编号：2818546
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