Men1在十二指肠胃泌素瘤中的作用及机制研究

发布时间：2020-09-15 21:26

　　目的(1)探讨十二指肠胃泌素瘤的起源及与Men1的关系。(2)建立小鼠十二指肠Glial细胞原代培养的方法。(3)明确EGF对小鼠十二指肠原代Glial细胞中Men1的调控作用及其机制。(4)探讨Men1基因在小鼠十二指肠胃泌素瘤中的作用。方法(1)免疫荧光技术检测人十二指肠胃泌素瘤标本中神经嵴来源细胞的标志物GFAP与S100B的表达,同时检测肿瘤组织与肿瘤旁正常组织中Menin的表达水平。(2)利用小鼠十二指肠固有层组织培养原代Glial细胞,免疫荧光及Western blot技术检测原代细胞中GFAP,SMA,E-cadherin及Pgp9.5的表达,流式细胞术检测Glial细胞的纯度。(3)EGF作用于小鼠原代Glial细胞,Q-PCR技术检测EGF作用后小鼠原代Glial细胞中Men1 m RNA的表达水平,细胞免疫荧光及Western blot技术检测EGF作用后小鼠原代Glial细胞中Menin的表达与分布;Elisa检测EGF作用后小鼠原代Glial细胞中胃泌素的分泌情况;生物信息学方法分析EGF对Menin作用的可能机制,然后用免疫荧光,Western blot及免疫沉淀技术进行验证。(4)构建条件性敲除Men1基因(Gastrin Cre ERT2)与全身性敲除Somatostatin基因小鼠模型(Gastrin Cre ERT2 Men1 fl/fl Sst-/-),同时对构建的小鼠模型予以奥美拉唑口服治疗,观察小鼠十二指肠胃泌素瘤的形成情况。结果(1)人十二指肠胃泌素瘤标本中神经嵴来源细胞的标志物GFAP与S100B均阳性。与肿瘤周围正常组织相比,人胃泌素瘤组织中Menin的表达水平较低,且主要分布于胞浆。(2)成功地从小鼠十二指肠固有层中培养出了GFAP阳性的原代细胞(原代Glial细胞);经免疫荧光和Western blot技术检测,原代细胞中GFAP阳性,但SMA,E-cadherin及Pgp9.5阴性;流式细胞技术检测发现GFAP阳性细胞的百分比达96%。(3)EGF作用于小鼠原代Glial细胞后,Men1 m RNA水平无明显改变,但Menin蛋白先核输出,然后在胞质中降解,且细胞分泌的胃泌素水平明显升高;生物信息学分析发现Erk2与Akt可能参与了EGF介导的Menin核输出和胞质降解,Western blot与免疫沉淀技术发现EGF作用后,Erk2与Akt被磷酸化,然后分别与Menin在胞核与胞质中结合,应用Erk2与Akt抑制剂后,Menin的核输出与胞质降解被阻滞。进一步用免疫沉淀技术发现EGF作用后,Menin的泛素化水平升高。(4)经过长达6个月的观察,条件性敲除小鼠Men1基因(Gastrin Cre ERT2)与全身性敲除Somatostatin基因,并辅以奥美拉唑治疗,小鼠十二指肠内无胃泌素瘤形成,血清胃泌素的水平无明显升高,十二指肠内Gastrin阳性细胞数也无显著增加。结论(1)十二指肠胃泌素瘤可能起源于神经嵴细胞(Glial细胞);Men1与十二指肠胃泌素瘤具有相关性。(2)我们成功地从小鼠十二指肠固有层中分离出原代Glial细胞;其纯度达96%,可用于体外实验研究。(3)EGF通过激活Erk2与Akt介导小鼠原代Glial细胞中Menin蛋白的核输出,并在胞质内经泛素-蛋白酶体系统降解,而Menin的降解促进十二指肠Glial细胞中胃泌素的释放。这说明EGF可以通过下调Menin的表达促进Glial细胞向胃泌素瘤转化。(4)Men1条件性敲除短期内(Gastrin Cre,6个月)并不能诱导小鼠十二指肠胃泌素瘤的形成,更长时间的观察及其他条件性敲除(如GFAP Cre)小鼠的构建将是下一步的研究方向。第一部分十二指肠胃泌素瘤的起源及与Men1的关系目的:探讨十二指肠胃泌素瘤的起源及与Men1的关系。方法:免疫荧光技术检测人十二指肠胃泌素瘤标本中神经嵴来源细胞的标志物GFAP与S100B的表达,同时检测肿瘤组织与肿瘤旁正常组织中Menin的表达水平。结果:人十二指肠胃泌素瘤标本中神经嵴来源细胞的标志物GFAP与S100B均阳性。与肿瘤周围正常组织相比,人胃泌素瘤组织中Menin的表达水平较低,且主要分布于胞浆。结论:十二指肠胃泌素瘤可能起源于神经嵴细胞(Glial细胞);Men1与十二指肠胃泌素瘤具有相关性。第二部分小鼠十二指肠原代Glial细胞的培养与鉴定目的:建立小鼠十二指肠Glial细胞原代培养的方法。方法:利用小鼠十二指肠固有层组织培养原代Glial细胞,免疫荧光及Western blot技术检测原代细胞中GFAP(神经嵴细胞标志物),SMA(成肌纤维细胞的标志物),E-cadherin(上皮细胞的标志物)及Pgp9.5(神经元细胞的标志物)的表达,流式细胞术检测Glial细胞的纯度。结果:成功地从小鼠十二指肠固有层中培养出了GFAP阳性的原代细胞(原代Glial细胞);经免疫荧光和Western blot技术检测,原代细胞中GFAP阳性,但SMA,E-cadherin及Pgp9.5阴性;流式细胞技术技术检测发现GFAP阳性细胞的百分比达96%。结论:我们成功地从小鼠十二指肠固有层中分离出原代Glial细胞;其纯度达96%,可用于体外实验研究。第三部分EGF对小鼠十二指肠原代Glial细胞中Men1的调控作用及其机制目的:明确EGF对小鼠十二指肠原代Glial细胞中Men1的调控作用及其机制。方法:EGF作用于小鼠原代Glial细胞,Q-PCR技术检测EGF作用后小鼠原代Glial细胞中Men1 m RNA的表达水平,细胞免疫荧光及Western blot技术检测EGF作用后小鼠原代Glial细胞中Menin的表达与分布;Elisa检测EGF作用后小鼠原代Glial细胞中胃泌素的分泌情况;生物信息学方法分析EGF对Menin作用的可能机制,然后用免疫荧光,Western blot及免疫沉淀技术进行验证。另外,利用小鼠十二指肠神经内分泌肿瘤细胞株STC1重复上述实验。结果:EGF作用于小鼠原代Glial细胞后,Men1 m RNA水平无明显改变,但Menin蛋白先核输出,然后在胞质中降解;且细胞分泌的胃泌素水平明显升高;生物信息学分析发现Erk2与Akt可能参与了EGF介导的Menin核输出和胞质降解,Western blot与免疫沉淀技术发现EGF作用后,Erk2与Akt被磷酸化,然后分别与Menin在胞核与胞质中结合,应用Erk2与Akt抑制剂后,Menin的核输出与胞质降解被阻滞。进一步用免疫沉淀技术发现EGF作用后,Menin的泛素化水平升高。上述实验结果可以在STC1细胞株中重复。结论:EGF通过激活Erk2与Akt介导小鼠原代Glial细胞中Menin蛋白的核输出,并在胞质内经泛素-蛋白酶体系统降解,而Menin的降解促进十二指肠Glial细胞中胃泌素的释放。这说明EGF可以通过下调Menin的表达促进Glial细胞向胃泌素瘤转化。第四部分条件性敲除Men1对小鼠血清胃泌素水平及十二指肠胃泌素瘤形成的影响目的:探讨Men1基因在小鼠十二指肠胃泌素瘤中的作用。方法:构建条件性敲除小鼠Men1基因(Gastrin Cre ERT2)与全身性敲除Somatostatin基因小鼠模型(Gastrin Cre ERT2 Men1 fl/fl Sst-/-),同时对构建的小鼠模型予以奥美拉唑口服治疗,观察小鼠十二指肠胃泌素瘤的形成情况。结果:经过长达6个月的观察,条件性敲除小鼠Men1基因(Gastrin Cre ERT2)与全身性敲除Somatostatin基因,并辅以奥美拉唑治疗,小鼠十二指肠内无胃泌素瘤形成,血清胃泌素的水平无明显升高,十二指肠内Gastrin阳性细胞数也无显著增加。结论:Men1条件性敲除短期内(Gastrin Cre,6个月)并不能诱导小鼠十二指肠胃泌素瘤的形成,更长时间的观察及其他条件性敲除(如GFAP Cre)小鼠的构建将是下一步的研究方向。
【学位单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.31
【部分图文】：

胃泌素瘤,十二指肠,免疫组化染色

99图 1 人十二指肠胃泌素瘤 HE 及免疫组化染色结果A-B 人十二指肠胃泌素瘤的 HE 染色结果（A: 20 倍镜；B: 100 倍镜）；C-D 十二指肠胃泌瘤 Gastrin 免疫组化染色结果（C: 20 倍镜；D: 100 倍镜））

融合图像,十二指肠,胃泌素,胃泌素瘤

图 2 人十二指肠胃泌素瘤 Gastrin 与 GFAP 免疫荧光染色结果（A: DAPI 染色；B: Gastrin 染色； C: GFAP 染色；D: 融合图像）图 3 人十二指肠胃泌素瘤 Gastrin 与 S100B 免疫荧光染色结果（A: DAPI 染色；B: Gastrin 染色； C: S100B 染色；D: 融合图像）

融合图像,胃泌素瘤,十二指肠,免疫荧光染色

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