量子点-磁珠传感体系的构建及其对肺癌标志物miRNA的检测

发布时间：2020-09-16 12:11

　　量子点(Quantum Dot,QD)是一种半导体纳米材料,它具有许多特殊的光学性质,包括:高量子产率、高摩尔消光系数、宽范围的吸收谱、窄而且对称的荧光光谱、大的斯托克斯位移和高的光化学稳定性。量子点的这些特性使它们在诊断和生物成像等领域展现出广泛的应用前景。肺癌是一种恶性肿瘤,致死率非常高。发展有效的肺癌标志物检测技术具有重要的科学意义和应用价值。作为一类新型的肺癌生物标志物,微小核糖核酸(micro RNA或mi RNA)已经吸引了研究人员的广泛关注。mi RNA是一类由18~25个核苷酸构成的非编码单链RNA。mi RNA的异常表达在肿瘤中普遍存在,且具有组织特异性,因而可以作为肿瘤检测的标志物。研究表明,mi RNA涉及到肺癌的多个阶段,包括肿瘤发展、癌细胞侵袭和转移等,因此mi RNA可以用作肺癌检测的生物标志物。在肿瘤的早期,血清中的肿瘤mi RNA标志物的浓度是非常低的,因此需要设计检测灵敏度足够高的传感器来检测微量的mi RNA。另一方面,某种特定的肿瘤不是由单一的mi RNA所调控,通常是多个高度相关的mi RNA同时调控,而单一mi RNA的检测特异性和灵敏度仍不够高,因此联合检测多种mi RNA是进行肿瘤早期检测的一种可行思路。本文通过构建量子点-磁珠(QD-MB)生物传感体系用于实现对肺癌标志物mi RNA的高灵敏、高特异性的多元检测。1.QD-MB生物传感器的构建及其对肺癌mi RNA标志物的检测。首先,利用生物素化的单链DNA分别与链酶亲和素功能化的量子点与磁珠构建mi RNA检测的探针:QD-DNA探针和MB-DNA探针;在含有QD-DNA和MB-DNA探针的缓冲液中加入目标肺癌标志物mi RNA后,两种探针分别与mi RNA发生碱基互补配对,形成一个“QD-DNA-mi RNA-DNA-MB”的三明治结构;接着用磁分离技术使未被MB-DNA探针捕获的QD-DNA探针与已经形成三明治结构的QD-DNA探针分离,通过检测上清液中残留的QD的荧光强度,发现随着目标mi RNA浓度的增大,量子点的荧光强度逐渐降低,通过对比未加入mi RNA靶分子前的荧光强度,可实现对mi RNA的定量检测。在工作中,我们构建QD-DNA-200b和QD-DNA-21两种不同的QD-DNA探针,并构建了对应的MB-DNA-200b、MB-DNA-21两种不同的MB-DNA探针,分别用于检测两种不同的肺癌标志物:mi RNA-200b和mi RNA-21。在Tris-HCl缓冲液中,mi RNA-200b的检测限达到0.73 fM,检测线性范围是10 fM-10 p M,mi RNA-21检测限达到1.16 fM,检测线性范围是10 fM-100 p M。为研究传感器的抗干扰能力,我们进一步利用QD-MB生物传感器对血清中的mi RNA进行了检测。在1%血清中,mi RNA-200b的检测限达到6.09 fM,检测线性范围是10 fM-10 p M;mi RNA-21检测限是3.90 fM,检测线性范围是10fM-100 p M。另外,通过对单碱基错配mi RNA和随机序列mi RNA的检测表明QD-MB传感器具有较好的检测特异性。本传感器可以实现两种肺癌标志物mi RNA-200b和mi RNA-21的同时检测,具有较高的检测灵敏度和较宽的检测范围,而且具有良好的特异性和抗干扰能力,为肺癌的早期诊断提供了技术支持。2.基于双链特异性核酸内切酶(Duplex-specific nuclease,DSN)的QD-MB核酸传感器的构建及其检测应用。DSN能够高选择性地识别并切割完全匹配的DNA双链或者RNA/DNA杂交双链中的DNA,而对单链DNA、RNA或者双链RNA没有作用。基于DSN的特异性剪切能力,我们设计了基于DSN信号放大的QD-MB荧光传感体系。首先,我们以mi RNA-21为靶分子构建了基于DSN放大的QD-MB核酸传感器。加入目标mi RNA-21与MB-DNA探针形成DNA-RNA双链,双链中的DNA可被DSN特异性切割,导致mi RNA-21被释放出来后可以继续与DNA探针杂交,引起DSN酶的对DNA探针的循环剪切,剪切完毕后与QD-DNA探针杂交,磁分离后检测上清液量子点的荧光信号。研究发现,随着加入mi RNA-21浓度的增大,量子点的荧光强度逐渐增大。该传感器的检测范围为1 p M-10 nM,达到4个数量级,检测限达到120 fM。
【学位单位】：南京邮电大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R734.2

【参考文献】