病毒巨噬细胞炎性蛋白-ⅡN端肽通过miR-155-3p逆转乳腺癌紫杉醇耐药的研究

发布时间：2020-09-16 20:05

　　 目的:探讨病毒巨噬细胞炎性蛋白ⅡN端肽(NT21MP)通过miR-155-3p逆转人乳腺癌细胞紫杉醇耐药的分子机制。方法:1.使用梯度浓度法构建人乳腺癌细胞MCF-7紫杉醇耐药株MCF-7/PR;2.qRT-PCR检测NT21MP对miR-155-3p的调控以及miR-155-3p在人乳腺癌细胞系MCF-7和紫杉醇耐药细胞株MCF-7/PR中不同的表达水平;3.生物信息学软件预测并使用双荧光素酶报告载体验证miR-155-3p的靶基因MYD88;4.构建并筛选稳定的靶基因干扰片段以及过表达载体;5.qRT-PCR和Western Blot检测miR-155-3p、靶基因MYD88对凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Bak-1、Caspase-3表达影响;6.划痕实验、transwell趋化实验、流式细胞术分别检测miR-155-3p、靶基因MYD88对细胞的迁移、侵袭、周期和凋亡的影响;7.构建人乳腺癌体内模型,研究乳腺癌细胞MCF-7以及MCF-7/PR的成瘤性以及miR-155-3p对肿瘤成长的影响;8.qRT-PCR和Western Blot检测NT21MP联合miR-155-3p mimics、MYD88干扰片段对乳腺癌耐药株MCF-7/PR内凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Bak-1、Caspase-3的作用;9.划痕实验、transwell趋化实验、流式细胞术检测NT21MP联合miR-155-3p mimics、MYD88干扰片段对乳腺癌耐药株MCF-7/PR迁移、侵袭、周期和凋亡的影响。结果:1.NT21MP可上调miR-155-3p的表达(P0.05);2.相比于MCF-7细胞,miR-155-3p在MCF-7/PR呈低水平表达(P0.05);3.生物信息学软件预测MYD88为miR-155-3p潜在的靶基因并通过qRT-PCR、Western Blot和双荧光素酶报告基因验证;4.miR-155-3p可抑制乳腺癌细胞的的生长,上调促凋亡基因Bax、Bak-1和Caspase-3而下调抗凋亡基因Bcl-2的表达,抑制细胞的迁移和侵袭能力(P0.05),而其靶基因MYD88则作用相反,促进乳腺癌细胞的增殖,增加细胞S期比例,增强细胞迁移和侵袭能力(P0.05);5.相比于单一因素处理,NT21MP联合miR-155-3p mimics在调控MCF-7/PR凋亡和侵袭方面显示出协同作用(P0.05),而在细胞迁移方面显示为部分叠加(P0.05);7.相对于NT21MP或者si-MYD88单独处理组,NT21MP联合si-MYD88在促进MCF-7/PR细胞凋亡和抑制侵袭能力中表现为协同效应(P0.05),抑制细胞迁移效果部分叠加(P0.05)。结论:NT21MP可通过上调miR-155-3p而下调MYD88的表达,逆转乳腺癌细胞紫杉醇耐药,增加乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性,发挥抗乳腺癌作用。
【学位单位】：蚌埠医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.9
【部分图文】：

实验结果第一部分：miR-155-3p 调控人乳腺癌细胞紫杉醇耐药机制研究1. miR-155-3p 靶基因的筛选及鉴定1.1 miR-155-3p 靶基因的筛选使 用 miRNA 靶 基 因 预 测 软 件 TargetScan ， miRanda ， miRTarBase 预 测miR-155-3p 的靶基因，选定 MAPK14、DNAJB1、IRAK3、SIRT1、MYD88 共五个基因作为 miR-155-3p 潜在的靶基因（图 1）

8 的 3'-UTR 区促进其降解，导致 MYD88-3'-UTR WT-miR-155-3p 组荧光性显著降低（P<0.05），而在 MYD88-3'-UTR MUT-miR-155-3p 组却未化（P>0.05），表明靶基因 3'-UTR 与 miRNAs 结合位点的突变，导致 miR接靶向互补靶基因 mRNA3'-UTR 区域，阻断了 miRNAs 直接对靶基因的 4）。

利用生物信息学软件确定 miR-155-3p 与 MYD88 互补序列（图3），构建含 MYD88 3'-UTR 的荧光素酶报告载体，荧光素酶活性实验结果显示，转染 miR-155-3p mimics 使 miR-155-3p 在 MCF-7 细胞内过度表达，结合于靶基因

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本文编号：2820316