肺癌来源的外泌体促进恶性胸腔积液形成的机制研究

发布时间：2020-09-17 15:28

　　研究背景恶性胸腔积液是指原发于胸膜的恶性肿瘤或其他部位的恶性肿瘤转移至胸膜腔引起的积液。肺癌是发生恶性胸腔积液最常见的原因。出现恶性胸腔积液表明肿瘤播散或已进展至晚期,患者预期寿命将显著缩短。恶性胸腔积液导致的呼吸困难、乏力等症状严重降低患者的生活质量。目前对于恶性胸腔积液的治疗主要集中在以缓解呼吸困难症状为目的的治疗性胸腔穿刺术、胸膜固定术或肋间埋管间断引流胸腔积液等措施,但这些治疗手段疗效不佳,患者复发率较高。其主要原因是目前恶性胸腔积液的形成机制不清。材料和方法通过流式细胞术分析临床初诊晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者血清及配对胸腔积液上清中外泌体标本细胞程式死亡-配体1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)水平,明确 PD-L1 和预后的关系,明确血清和配对胸腔积液外泌体上PD-L1的一致性。分析不同荧光强度PD-L1水平的胸腔积液中常见免疫细胞的数量。2.构建胸腔积液动物模型,基于动物模型基础上探讨胸腔内肿瘤来源外泌体(tumor-derived exosomes,TEX)和磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)胸腔内注射后对胸腔积液形成的影响,通过CD31染色、RNA转录组测序等明确TEX在促进胸腔积液形成过程中的初步机制。3.在胸腔积液动物模型基础上,收集外泌体处理和PBS处理过的肿瘤组织、消化、研磨获取细胞悬液,流式细胞术检测CD4+T细胞,CD8+T细胞、B淋巴细胞,巨噬细胞,树突状细胞,嗜中性粒细胞,自然杀伤细胞的比例并进行比较。从小鼠中取出新鲜脾脏,研磨制成单细胞悬液,分选CD8+T细胞,加入TEX和PBS,共孵育并收集细胞进行流式分析。检测肿瘤杀伤能力。免疫细胞缺陷的裸鼠体内重复相同的实验,确认TEX促进胸腔积液形成是否与改变免疫细胞比例有关。4.检测,TEX上的PD-L1的水平。将高表达PD-L1的TEX加入到正常C57BL/6小鼠来源的CD8+ T细胞中,检测其增殖能力。将抗PD-L1抗体和对照抗体与TEX孵育,再将TEX吸附至乳胶微粒进行流式分析,确认抗体的阻断效果。之后将对照抗体和抗PD-L1抗体孵育后的TEX加入到小鼠来源的经活化的免疫细胞中,收集细胞进行流式分析。5.将TEX与抗PD-L1抗体孵育后,流式检测TEX上PD-L1的水平,确定抗体的阻断效果。将抗PD-L1抗体加入到PBS或TEX中孵育,再将其加入到体外培养的免疫细胞中。检测免疫细胞的体外杀伤肿瘤能力和体外增殖能力,明确其对免疫细胞的抑制作用。将阻断PD-L1的TEX打入小鼠胸腔内,分析成瘤后胸腔积液中免疫细胞的数量及胸腔积液的形成。实验结果1.66例患者血清外泌体流式检测发现,所有患者外泌体均存在不同程度的PD-L1,流式细胞显示平均荧光强度范围23.5-308,而25例健康对照组血清外泌体PD-L1平均荧光强度范围5.1-15.2,两组PD-L1水平有显著统计学差异(P0.001)。配对胸腔积液检测发现,胸腔积液中PD-L1也同样存在高表达情况,与血清外泌体上PD-L1表达存在正相关。而良性胸腔积液中外泌体上PD-L1水平较恶性胸腔积液显著降低,同时分析发现,PD-L1高的胸腔积液和低的胸腔积液上存在CD8+T细胞数量的差异,PD-L1高的胸腔积液中CD8+T细胞比例低。进一步分析发现血清PD-L1水平高的患者,其预后较差,这提示外泌体上PD-L1可能通过某种途径促进肿瘤增殖和转移。2.将LLC细胞注射入小鼠胸腔内,同期分别给予30ug/50uLTEX和等量的PBS连续三次腔内注射。第5天和14天活体成像结果显示TEX组的小鼠胸腔内的肿瘤成像强度明显强于PBS组。第14天将小鼠处死后打开胸腔,与PBS组相比,TEX组出现更多的肉眼可见的肿瘤组织,胸水的体积也更多。处死前尾静脉注射伊文思蓝(Evans'blue)溶液至小鼠体内,TEX组的胸水中的Evans'blue的量多于PBS组,证明TEX组的小鼠胸腔的血管渗透能力更强,这有利于胸水形成。这些结果说明TEX的胸腔注射能明显促进胸腔肿瘤的生长和胸水的生成。3.将成瘤后14天的小鼠的肿瘤组织及胸膜取出,切片后对组织切片进行CD31的免疫组化及免疫荧光染色。结果显示,TEX组的肿瘤内血管数量明显多于PBS组,TEX组的胸膜组织的血管标记物CD31的表达也强于PBS组。同时胸膜mRNA转录组测序发现血管内皮生长因子受体(vascular endothelial cell growth factor,VEGF)及IL-6表达在TEX组也较PBS组显著升高,这些指标被证实和免疫抑制密切相关。4.流式分析肿瘤组织细胞悬液发现,与PBS组相比,TEX组内胸膜腔肿瘤细胞悬液的CD8+T细胞的数量显著下降,而中性粒细胞、CD4+T细胞、NK细胞、巨噬细胞和B细胞的数量没有显著差异。进一步分析发现TEX还抑制CD8+ T细胞的活化标志物CD69和interferony IFN-γ)的表达。TEX组来源的CD8+T细胞的肿瘤杀伤能力也明显弱于PBS组。5.T细胞缺陷的裸鼠体内进行了相同的实验,结果发现在裸鼠体内TEX并不能促进胸腔肿瘤的生长。胸水体积以及胸水内Evans' blue的量在PBS和TEX两组之间没有明显差异。6.检测了 TEX上的PD-L1的表达。流式分析显示TEX上有丰富的PD-L1表达。将高表达PD-L1的TEX加入到正常C57BL/6小鼠来源的CD8+ T细胞中,结果显示,TEX处理的CD8+T细胞的增殖能力明显减弱。7.将抗PD-L1抗体加入到PBS或TEX中孵育,再将其加入到体外培养的CD8+T细胞中。结果显示,阻断PD-L1之后TEX对CD8+ T细胞的抑制作用消失。体内实验中,阻断PD-L1的TEX打入小鼠胸腔内,结果显示,阻断PD-L1之后TEX不再抑制CD8+ T细胞的数量。小鼠胸腔内注射PD-L1抗体阻断的TEX,结果显示,TEX无法促进胸腔肿瘤的生长及胸腔积液的增加。结论1.肿瘤患者血清和配对胸腔积液中外泌体中普遍存在PD-L1表达,表达水平越高的患者预后越差,提示外泌体上PD-L1表达可以作为预后标志物。血清和配对胸腔积液中PD-L1表达有一定的相关性。同时,高表达PD-L1的胸腔积液中CD8+T比例偏低。2.动物实验发现,TEX能够促进胸腔积液的形成,其作用和TEX能够促进胸膜血管通透性增加有一定的关系。3.进一步研究发现,TEX上PD-L1表达水平比较高的患者CD8+ T细胞的增殖能力明显减弱,TEX高表达PD-L1能体外抑制CD8+T细胞的增殖并降低其杀伤能力。4.通过抗PD-L1药物干预发现,TEX介导的促肿瘤作用依赖于PD-L1,外泌体上的PD-L1表达通过降低CD8+ T细胞比例最终促进了胸腔积液的产生。
【学位单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R730.2
【部分图文】：

血清,患者,胸腔积液,内质网

图１：血清中外泌体透射电镜技术检测（图Ａ：放大６００００倍；图Ｂ：９００００明确的脂质双层结构，大小在５０－１５０ｎｍ之间．符合典型外泌体特征。Ｗｅｓｔｅ提取物高表达ＣＤ６３和ＴＳＧ１０１．而与内质网形成有关的蛋白ＧＲＰ９４不存一步说明我们所离心获取的提取物是内体来源．句内质网无关；这表明．外泌体（图Ｃ）。逡逑３．２．患者及健康对照人群一般特征逡逑我们共获取６６例晚期非小细胞肺癌患者的血清，２５例健康对照晚期肺癌患者中，男性４１例，女性２５例，中位年龄５８岁，其中例，３１例为既往或正在吸烟。其中３７例患者体能状况评分为１分。腺癌患者占比最高，共５８例患者。其中发生胸腔积液转移的有胸腔积液转移的患者５１例。所有患者均未接受过放疗、化疗

肿瘤,来源,流式,患者

图３：肿瘤来源外泌体和健康人群的外泌体进行流式检测ＰＤ－Ｌｌ，结果显示，肿瘤来体上ＰＤ－Ｌ１较健康人群显著升高，中位值分别为９０．０和９．２邋（Ｐ＜０．００１）（图Ａ）。ｂｌｏｔ分析显示，ＰＤ－Ｌ１蛋白表达在肿瘤来源外泌体上高表达，而在健康人外泌体上低表Ｂ）邋0逡逑３．４氋与低ＰＤ－Ｌ１表达患者的临床特征差异逡逑我们以６６例患者的ＰＤ－Ｌ１表达比例的中位值为ｃｕｔ－ｏｆｆ值（中位ＭＦＩ值为将６６例患者分为两组，其中高表达组为３３人，低表达组为３３人。两组一般特征见表２．逡逑比较发现，高水平ＰＤ－Ｌ１组的患者ＩＶｂ患者比例偏高，这提示肿瘤负荷和位多少可能影响患者的ＰＤ－Ｌ１水平，肿瘤转移越广泛，其外泌体ＰＤ－Ｌ１

患者,胸腔积液,疗效,部分缓解

图４：以ＭＦＩ＝９０为分界．结果显示，高ＭＦＩ组无论ＰＦＳ邋（图Ａ）还是ＯＳ均显著降低（Ｂ）邋0逡逑３．６邋ＰＤ－Ｌ１邋＾＾检测逡逑我们对１２例患者进行了动态检测，获取了邋１２例患者治疗两周期后的外泌体并行ＰＤ－Ｌ１检测，结果发现，总体上来讲，两周期后ＰＤ－Ｌ１水平显著降低。但３例患者上升，其中上升组的３例患者的疗效为２例进展（ＰＤ），邋１例为稳定（ＳＤ）而降低组患者的疗效为６例部分缓解（ＰＲ），３例稳定（ＳＤ），未见进展（ＰＤ患者。逡逑３．７配对胸腔积液ＰＤ－Ｌ１表达及免疫细胞分析逡逑６６例患者中，其中１５例患者初诊时存在胸腔积液，我们获取了邋１１例患者的腔积液，对胸腔积液上清进行超离获取外泌体，同时获取３例非肿瘤患者的胸

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