肿瘤化HUVEC疫苗联合DC-CT26疫苗抗小鼠结直肠癌移植瘤的研究

发布时间：2020-09-18 08:07

　　实体肿瘤的生长和转移有赖于新生血管的形成,因此通过抗肿瘤血管生成抑制肿瘤的进展成为医学工作者研究的热点。近来研究表明,以血管生成相关抗原为靶点的疫苗可以引发机体产生特异性细胞和体液免疫反应,通过抑制新生血管的生成,起到阻止肿瘤细胞生长和转移的作用。其中,以人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)作为抗原制备的全细胞疫苗抗肿瘤血管生成的研究发现,该疫苗虽能引起一定程度的免疫应答,但治疗效果仍然较为有限,有必要对该疫苗进一步优化。肿瘤血管内皮细胞与正常血管内皮细胞在生长因子受体、信号转导分子及黏附分子等方面有显著差异。我们设想体外模仿肿瘤微环境诱导HUVEC,使其接近肿瘤血管内皮细胞特性,用诱导后的HUVEC作为疫苗可能比HUVEC疫苗产生更好的抑制肿瘤血管生成的效果。查阅文献后,该方面研究尚未见报道。课题组前期已建立了体外采用肿瘤细胞培养上清模拟肿瘤微环境的方法,本研究采用小鼠结直肠癌CT26细胞培养上清液模拟肿瘤微环境诱导HUVEC,诱导后的HUVEC均高表达肿瘤血管内皮细胞标志物,迁移和侵袭能力增强,与肿瘤血管内皮细胞特性相似,故称诱导后的HUVEC为肿瘤化HUVEC。机体对自身或同种异体的抗原存在免疫耐受的情况,但异种疫苗可打破机体对自身抗原的免疫耐受,易被宿主机体的免疫系统识别并加以排斥。用肿瘤微环境诱导的人内皮细胞接种小鼠,可打破免疫耐受并诱导产生特异性抗血管生成免疫应答,破坏肿瘤新生血管,抑制肿瘤生长。树突状细胞(Dendritic cells,DC)是体内功能最强大的专职抗原递呈细胞,它能够摄取肿瘤抗原,诱导细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T-lymphocytes,CTL)介导强大的特异性抗肿瘤免疫效应。目前DC疫苗种类繁多,本实验采用小鼠骨髓来源的DC负载CT26细胞冻融抗原,即DC-CT26疫苗。该疫苗携带全部的肿瘤抗原,无需分离特异的抗原肽,无需确定MHC的单元型和MHC限制性的抗原决定簇,通过诱导CTL免疫应答产生抗肿瘤作用。结直肠癌是世界范围内第四大导致死亡的癌症,每年有超过120万名新诊断的病人和60余万人死于该病,2017年国家癌症中心数据显示,在中国它的发病率和死亡率都排在第五位。早期结直肠癌无症状,通常要到晚期才能被诊断出来,结直肠癌的5年生存率不到10%,因此迫切需要制定新的策略来治疗结直肠癌。本研究采用小鼠结直肠癌细胞上清诱导HUVEC,制备肿瘤化HUVEC疫苗,主要通过激活体液免疫发挥抗肿瘤血管生成作用;制备负载CT26细胞冻融抗原的DC-CT26疫苗,其主要通过激活细胞免疫杀伤结直肠癌细胞。两种疫苗联合应用一方面产生抗结直肠癌血管内皮细胞效应,另一方面产生抗结直肠癌细胞的作用,以提高抗结直肠癌效果。第一部分肿瘤化HUVEC疫苗抗小鼠结直肠癌血管生成的作用材料与方法1.采用小鼠结直肠癌CT26细胞培养上清模拟肿瘤微环境,通过划痕、侵袭实验和Western blot等方法检测肿瘤微环境对HUVEC的影响。2.肿瘤化HUVEC疫苗:(1)收CT26细胞上清:CT26细胞常规培养,待细胞汇合度约80%时,换5ml/dish含10%胎牛血清的1640培养基,24h后收集培养液,3000r/min离心5min,收集上清,-20℃保存备用。(2)制备肿瘤化HUVEC疫苗:HUVEC常规培养,待细胞汇合度约60%时换条件培养基,加入量10ml/dish,培养48h,即为肿瘤化HUVEC。培养48h后,HUVEC消化、离心弃上清后加入0.025%戊二醛,混匀后4℃避光固定20min,PBS重悬调浓度至2.5×10~7/ml,-80℃保存备用。3.实验动物和分组:将SPF级4-6周龄、雌性BALB/c小鼠21只(20-22g)饲养于屏障系统中,随机分成PBS组、HUVEC组和Induced HUVEC组,每组7只,在小鼠腋窝淋巴结周围接种疫苗,PBS组:每只注射0.2ml的PBS作为空白对照,1次/周,共5周;HUVEC组:每只注射0.2ml HUVEC疫苗(2.5×10~7/ml),1次/周,共5周;Induced HUVEC组:每只注射0.2ml肿瘤化的HUVEC疫苗(2.5×10~7/ml),1次/周,共5周。接种结束后的第7天,对各组小鼠进行背部皮下注射CT26细胞(1×10~5个/只)。接种CT26细胞后第11天起,隔天测量瘤体并观察瘤体生长及小鼠存活情况,第24天,眼眶取血后拉颈处死小鼠。4.肿瘤标本的处理:收集肿瘤组织称重并拍照,一部分肿瘤组织用10%中性甲醛固定后石蜡包埋,常规制片,用于免疫组化;另一部分-80℃保存,用于血红蛋白和Western blot实验。5.免疫组化检测肿瘤组织中CD31的表达,判定肿瘤组织血管生成情况。血红蛋白实验检测肿瘤组织研磨物上清中血红蛋白的浓度,间接反映肿瘤血管生成情况。Western blot检测肿瘤血管内皮细胞标志物(TEM1、TEM8和VEGFR2),判定肿瘤组织中血管生成情况。6.提取各组小鼠的血清做一抗,孵育肿瘤化HUVEC总蛋白,通过Western blot检测小鼠血清中产生的增殖相关抗体表达水平。ELISA检测各组小鼠血清中HUVEC抗体产生的情况。结果1.划痕实验结果显示:与对照组和40%CT26细胞上清诱导组相比,60%CT26细胞上清诱导组的内皮细胞迁移数最多(P0.001,P0.001)。2.侵袭实验结果显示:与对照组和40%CT26细胞上清诱导组相比,60%CT26细胞上清诱导组的内皮细胞侵袭数最多(P0.001,P0.001)。3.Western blot结果显示:与对照组相比,60%CT26细胞上清诱导组的肿瘤血管内皮细胞标志物TEM1、TEM8、VEGFR2表达明显增高(P0.001)。4.各组小鼠肿瘤体积和重量结果显示:与PBS组和HUVEC组相比,Induced HUVEC组的小鼠肿瘤体积最小(P0.001,P0.05)和重量最轻(P0.001,P0.05)。5.免疫组化实验结果显示:与PBS组和HUVEC组相比,Induced HUVEC组肿瘤组织微血管密度最少(P0.001,P0.01);血红蛋白实验结果显示:与PBS组和HUVEC组相比,Induced HUVEC组肿瘤组织中血红蛋白含量最少(P0.001,P0.01)。Western blot结果显示:与PBS组和HUVEC组相比,Induced HUVEC组肿瘤组织中血管内皮标志物TEM1、TEM8、VEGFR2表达明显减低(P0.001,P0.01)。6.Western blot初步检测发现在分子量为165kD、130kD、63kD处出现阳性条带,与购买的TEM1、VEGFR2和TEM8一抗孵育肿瘤化HUVEC总蛋白后产生的目的条带分子量一致,初步推断分子量为165kD的条带可能为TEM1,分子量为130kD的条带可能为VEGFR2,分子量为63kD的条带可能为TEM8。7.ELISA结果显示:与PBS组和HUVEC组相比,Induced HUVEC组小鼠体内产生的HUVEC抗体效价最高(P0.001,P0.01)。第二部分肿瘤化HUVEC疫苗联合DC-CT26疫苗抗小鼠结直肠癌移植瘤的作用材料与方法1.DC-CT26疫苗制备:反复冻融法获得CT26细胞抗原,测CT26细胞裂解物的浓度后,-80℃保存备用。小鼠骨髓源DC培养第5天,加入CT26细胞裂解物(100μg/ml),培养至第8天,胰酶消化收获DC,即得到DC-CT26疫苗,PBS重悬调整浓度至5×10~6/ml。2.实验动物和分组:将SPF级4-6周龄、雌性BALB/c小鼠140只(20-22g左右)饲养于屏障系统中,随机分成PBS组、DC-CT26组、Induced HUVEC组和Combined group组,每组8只,在小鼠腋窝淋巴结周围接种相应的疫苗。PBS组:每只注射0.2ml的PBS作为空白对照;1次/周,共5周;DC-CT26组:每只注射0.2ml所制备DC-CT26疫苗(5×10~6/ml),1次/周,共5周;Induced HUVEC组:每只注射0.2ml诱导的HUVEC疫苗(2.5×10~7/ml),1次/周,共5周;Combined group组,一侧腋窝淋巴结周围注射0.2ml所制备DC-CT26疫苗(5×10~6/ml),另一侧腋窝淋巴结周围注射0.2ml所制备Induced HUVEC疫苗(2.5×10~7/ml),1次/周,共5周。3.同样方法注射CT26细胞后第10天起,隔天测量瘤体并观察瘤体生长及小鼠存活情况;第28天,眼眶取血后处死所有小鼠,收集肿瘤组织称重并拍照。利用免疫组化、血红蛋白实验、Western blot和ELISA检测肿瘤组织新生血管的情况以及小鼠体内产生的内皮细胞抗体。4.剥离各组小鼠脾脏组织,称重并拍照,计算脾脏指数检测机体的免疫功能;按照Cyto Tox96~?非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书进行操作,检测小鼠体内CTL对CT26细胞的杀伤作用;按照小鼠IFN-γ酶联免疫试剂盒说明书进行操作,检测小鼠血清中IFN-γ的含量;从小鼠脾脏组织中分离得到淋巴细胞;通过流式细胞仪检测各组小鼠脾脏组织中CD3~+、CD8~+T淋巴细胞的表达情况。结果1.各组小鼠肿瘤体积和重量结果显示:与PBS组相比,DC-CT26组、Induced HUVEC组和Combined group组小鼠肿瘤体积明显减少(P0.05,P0.01,P0.01),小鼠重量明显降低(P0.05,P0.001,P0.001),并且Combined group组小鼠肿瘤体积明显低于DC-CT26组和Induced HUVEC组(P0.01,P0.05),小鼠重量也明显低于DC-CT26组和Induced HUVEC组(P0.05,P0.05)。抑瘤率结果显示:Combined group组的抑瘤率强于DC-CT26组和Induced HUVEC组相(P0.001,P0.05)。2.免疫组化结果显示:与PBS组相比,Induced HUVEC组和Combined group组肿瘤组织微血管密度明显减少(P0.001,P0.001),并且Combined group组肿瘤组织微血管密度明显少于DC-CT26组和Induced HUVEC组(P0.001,P0.01)。血红蛋白实验结果显示:与PBS组相比,DC-CT26组、Induced HUVEC组和Combined group组肿瘤组织中血红蛋白含量明显减少(P0.001,P0.001,P0.001),并且Combined group组肿瘤组织中血红蛋白含量低于DC-CT26组和Induced HUVEC组(P0.001,P0.01)。Western blot结果显示:与PBS组相比,Induced HUVEC组和Combined group组中肿瘤组织内血管内皮细胞标志物TEM1、TEM8、VEGFR2表达明显降低(P0.001,P0.001),并且Combined group组中肿瘤血管内皮细胞标志物TEM1、TEM8、VEGFR2表达明显低于DC-CT26组和Induced HUVEC组(P0.001,P0.01);3.Western blot初步检测发现在分子量为165kD、130kD、63kD处出现阳性条带,与购买的TEM1、VEGFR2和TEM8一抗孵育肿瘤化HUVEC总蛋白后产生的目的条带分子量一致,初步推断分子量为165kD的条带可能为TEM1,分子量为130kD的条带可能为VEGFR2,分子量为63kD的条带可能为TEM8。4.ELISA结果显示:Induced HUVEC组和Combined group组小鼠体内产生的HUVEC抗体效价高于PBS组(P0.01,P0.01),并且Combined group组小鼠体内产生的HUVEC抗体效价高于DC-CT26组和Induced HUVEC组(P0.01,P0.05)。5.各组小鼠脾脏组织重量结果显示:与PBS组相比,DC-CT26组、Induced HUVEC组和Combined group组小鼠脾脏组织重量明显增高(P0.001,P0.001,P0.001),并且Combined group组小鼠脾脏组织重量高于DC-CT26组和Induced HUVEC组(P0.05,P0.05);脾脏指数显示DC-CT26组、Induced HUVEC组和Combined group组小鼠脾脏指数高于PBS组(P0.01,P0.05,P0.001),并且Combined group组小鼠脾脏指数高于DC-CT26组、Induced HUVEC组(P0.01,P0.01)。6.杀伤实验结果显示:与PBS组相比,DC-CT26组、Induced HUVEC组和Combined group组小鼠体内CTL对CT26细胞的杀伤效果增强(P0.001,P0.01,P0.001),并且Combined group组小鼠体内CTL对CT26细胞的杀伤效果强于DC-CT26组和Induced HUVEC组(P0.001,P0.001)。7.ELISA结果显示:与PBS组相比,DC-CT26组、Induced HUVEC组和Combined group组小鼠体内的IFN-γ的含量增高(P0.001,P0.001,P0.001),并且Combined group组小鼠体内的IFN-γ的含量高于DC-CT26组和Induced HUVEC组相(P0.001,P0.001)。8.流式细胞术的实验结果显示:与PBS组相比,DC-CT26组和Combined group组小鼠脾脏组织内CD3~+CD8~+T淋巴细胞的含量增高(P0.01,P0.001),并且Combined group组小鼠脾脏组织内CD3~+、CD8~+T淋巴细胞的含量高于DC-CT26组和Induced HUVEC组(P0.001,P0.001)。结论1.肿瘤化HUVEC疫苗抑制小鼠结直肠瘤效果优于HUVEC疫苗。2.肿瘤化HUVEC疫苗和DC-CT26疫苗的联合应用比单独应用具有更好的抑瘤效果。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.34
【部分图文】：

划痕实验,实验统计,细胞数,标志物

图 1. CT26 上清对 HUVEC 迁移和侵袭能力的影响. 通过划痕实验统计不同浓度的 CT26上清在诱导 HUVEC 24h 和 48h 时 HUVEC 迁移的细胞数；通过侵袭实验统计不同浓度的CT26 上清在诱导 HUVEC 24h 时 HUVEC 侵袭的细胞数。每组数据均重复三次。A.划痕实验检测 HUVEC 的迁移能力（scale bar，50μm）；B.侵袭实验检测 HUVEC 的侵袭能力（scalebar，50μm）（***P＜0.001）。3.1.2 肿瘤微环境诱导后 HUVEC 表达肿瘤血管内皮细胞标志物的情况HUVEC 是体外培养并处于增殖状态的内皮细胞，携带有与肿瘤血管内皮细胞相同的增殖相关抗原，但其与肿瘤微环境下的血管内皮细胞仍有较大差异。通过 Western blot 检测肿瘤微环境诱导后的 HUVEC 肿瘤血管内皮细胞标志物（TEM1、TEM8 和 VEGFR2）的表达水平。结果显示，60%CT26 上清诱导 HUVEC48h 后，HUVEC 高表达肿瘤血管内皮细胞标志物（P＜0.001）（图 2）。

标志物,细胞,细胞数

1. CT26 上清对 HUVEC 迁移和侵袭能力的影响. 通过划痕实验统计不同浓度的 C清在诱导 HUVEC 24h 和 48h 时 HUVEC 迁移的细胞数；通过侵袭实验统计不同浓T26 上清在诱导 HUVEC 24h 时 HUVEC 侵袭的细胞数。每组数据均重复三次。A.划检测 HUVEC 的迁移能力（scale bar，50μm）；B.侵袭实验检测 HUVEC 的侵袭能力（ar，50μm）（***P＜0.001）。.1.2 肿瘤微环境诱导后 HUVEC 表达肿瘤血管内皮细胞标志物的情况HUVEC 是体外培养并处于增殖状态的内皮细胞，携带有与肿瘤血管内皮相同的增殖相关抗原，但其与肿瘤微环境下的血管内皮细胞仍有较大差异过 Western blot 检测肿瘤微环境诱导后的 HUVEC 肿瘤血管内皮细胞标志TEM1、TEM8 和 VEGFR2）的表达水平。结果显示，60%CT26 上清诱导 HUV8h 后，HUVEC 高表达肿瘤血管内皮细胞标志物（P＜0.001）（图 2）。

去激,结直肠癌,划痕实验,实验统计

26图3. 60%去激素的结直肠癌细胞上清的HUVEC的影响. 通过划痕实验统计60%去激素的结直肠癌细胞上清在诱导 HUVEC 24h 和 48h 时 HUVEC 迁移的细胞数；通过侵袭实验统计60%去激素的结直肠癌细胞上清在诱导 HUVEC 24h 时 HUVEC 侵袭的细胞数；通过RT-qPCR 检测肿瘤血管内皮细胞特异性标志物的表达。每组数据均重复 3 次每组数据均重复三次。A. 划痕实验检测 HUVEC 的迁移能力（scale bar，80μm）；B. 侵袭实验检测 HUVEC的侵袭能力（scale bar，40μm）；C. RT-qPCR 检测肿瘤血管内皮细胞特异性标志物 TEM1、TEM8 和 VEGFR2 mRNA 的表达（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）。

【参考文献】