Nogo-B受体增强雌激素受体阳性乳腺癌紫杉醇耐药的研究

发布时间：2020-09-18 06:11

　　 目的:内源性或获得性化疗耐药已成为人类攻克肿瘤的一大障碍。然而仅有7%-16%的雌激素受体(estrogen receptor,ER)阳性乳腺癌患者在接受新辅助化疗后可以达到pCR。Nogo-B受体(NgBR)是一种细胞膜蛋白受体,其可以与法尼基化的原癌基因RAS结合并促使RAS迁移至细胞膜。本实验的目的在于检测NgBR的表达量是否会影响ER阳性乳腺癌细胞接受紫杉醇(paclitaxel,PTX)的治疗疗效,在此过程中NgBR在ERα介导的信号通路发挥的作用,并深入地探讨NgBR在紫杉醇耐药过程中的分子机制。方法:1.应用免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)技术对38名ER阳性乳腺癌患者新辅助前的肿物穿刺组织切片和新辅助化疗后的乳腺残留癌组织切片进行NgBR和Nogo-B染色,结合其病理结果和NgBR、Nogo-B的表达量分析两者相关性。2.在体外实验中检测NgBR在雌激素(Estradiol,E2),PTX治疗及两者联合作用对人乳腺癌T47D/MCF-7细胞生物学行为的影响,包括:CCK-8法检测细胞活性;集落形成实验检测细胞形成集落的能力;AO/EB双荧光染色法和Annexin V-FITC/propidium iodide(PI)染色联合流式细胞术检测细胞凋亡。3.人乳腺癌细胞T47D细胞经NgBR敲降处理后,加以E2刺激,应用Western Blot法检测细胞中凋亡相关蛋白(p53,survivin)和相关信号传导通路(如phos-Akt,phos-ERK,phos-ERα)的表达水平。4.乳腺癌细胞T47D和MCF-7经NgBR敲降处理后,加以E2刺激,应用染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)技术检测 ERα与 ERα靶基因上的雌激素应答元件(estrogen-responsive element,ERE)结合及p53与survivin 启动子区结合的变化。5.在体外实验中,检测NgBR在表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF),PTX治疗及两者联合作用是对人乳腺癌T47D细胞生物学行为的影响,包括:CCK-8法检测细胞活性;集落形成实验检测细胞形成集落的能力;AO/EB双荧光染色法和Annexin V-FITC/PI染色联合流式细胞术检测细胞凋亡。6.乳腺癌细胞T47D细胞经NgBR敲降处理后,加以EGF刺激,应用Western Blot法检测细胞中survivin和相关信号传导通路(如phos-Akt,phos-ERK,phos-ERα)的表达水平。7.乳腺癌细胞T47D细胞经E2或EGF刺激后,应用Real time RT-PCR技术,检测NgBR和survivin mRNA表达水平的变化。结果:在此文章中,我们证明了 NgBR可以作为一种潜在的靶标用来削弱雌激素受体α阳性乳腺癌的紫杉醇耐化疗效果。首先,通过分析临床ER阳性乳腺癌患者新辅助化疗前后的病理切片结果,我们发现84%的患者对新辅助化疗并没有应答或仅产生部分应答。在这部分患者中,近74%在接受新辅助化疗前具有高表达的NgBR水平,经过新辅助化疗后,其中58%患者的残留乳腺癌中NgBR表达量进一步增高。利用基因表达数据库内的信息和Kaplan-Meier分析,我们发现高表达NgBR mRNA(NUS1)的ER阳性,Her-2阴性乳腺癌患者无复发生存率(Recurrence Free Survival,RFS)明显降低。在此基础上,我们利用人乳腺癌细胞T47D和MCF-7证明了在ER阳性乳腺癌细胞中敲降NgBR,可明显抵抗由E2或EGF诱导的促细胞增殖作用,降低细胞活性与集落形成能力;协助PTX抵抗E2或EGF导致的肿瘤耐药,使细胞对PTX的细胞毒性作用重获敏感性,促进细胞凋亡。为了进一步研究NgBR增加ERα阳性乳腺癌紫杉醇耐药性的分子机制,我们利用Western Blot技术检测相关信号通路和蛋白的表达,结果表明敲降NgBR后通过下调其介导的PI3K/AKT和MAPK/ERK通路调节p53和survivin的表达从而增强紫杉醇诱导的细胞凋亡。NgBR敲降可分别削弱E2或EGF刺激所诱导的ERα磷酸化。Real time RT-PCR技术结果证明,E2或EGF刺激可上调ERα阳性乳腺癌细胞T47D内NgBR和survivin的蛋白和mRNA表达水平。最后,利用ChIP-PCR实验我们在分子水平上进一步证实了,敲降NgBR后,减少了 ERα与ERα靶基因上的雌激素应答元件结合,并通过增强p53在survivin启动子区的富集而下调survivin的转录水平。结论:在此项研究中我们发现,NgBR在ER阳性乳腺癌患者新辅助化疗后的残留乳腺癌中呈高表达状态。敲降NgBR后可上调p53(肿瘤抑制因子)的表达水平,抑制survivin的蛋白表达,此过程通过下调Akt和ERK的磷酸化实现。同时在分子水平上我们发现,NgBR敲降可增强p53结合至survivin的启动子区,从而抑制survivin的表达。此外,敲降NgBR可明显削弱E2或EGF诱导的紫杉醇耐药。敲降NgBR可通过下调EGF诱导的Akt、ERK、ERα磷酸化和survivin的表达。我们的实验阐明了 NgBR在ERα阳性乳腺癌紫杉醇获得性耐药中发挥了的重要作用。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.9
【部分图文】：

图 1.1 Nogo-B, NgBR 和 PECAM-1 在新生血管的定位（箭头所示）。Figure 1.1 Localization of Nogo-B, NgBR, and PECAM-1 in angiogenic blood vessels (arrows)[21].Baofeng 及其同事利用斑马鱼模型系统进一步阐述了 NgBR 和 Nogo-B 如何

图 1.2 敲降 NgBR 和 Nogo-B 对斑马鱼节间血管形成期的影响。NgBR 敲降阻断节间血管的形成。Figure 1.2 Effects of zNgBR and zNogo-B MO-injection on ISV formation. zNgBRMO blocks ISV formation[28].

NgBR 调节内皮氮氧合酶偶联 Akt 信号通路，敲降 NgBROS 和磷酸化 Akt 的基础水平以及被 VEGF 激活后的表达ure 1.3 NgBR modulates eNOS coupling through Akt pathwn in control PAECs decreased the basal phosphorylation of eNs well as VEGF-stimulated phosphorylation of eNOS and Akt

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本文编号：2821309