MMPs抑制剂通过改善肿瘤微环境提高CTLA-4抗体治疗乳腺癌的实验研究

发布时间：2020-09-17 22:01

　　乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤。以CTLA-4为靶点的免疫治疗是极具前景的抗肿瘤治疗方案，利用CTLA-4抗体（a-CTLA-4）能够促进T细胞重新活化、增殖，提高机体的抗肿瘤免疫应答。本课题组前期动物实验中，单独使用a-CTLA-4治疗乳腺癌效果并不理想。近年来，越来越多研究显示肿瘤微环境（TME）成为肿瘤免疫逃逸以及调控肿瘤对抗癌药物敏感性的关键因素，以TME为靶点的治疗学研究为恶性肿瘤的治疗带来了新的希望。基质金属蛋白酶（MMPs）能够作用于TME内多种成分，促进肿瘤的发生、发展。因此，本课题组拟应用MMPs抑制剂（MMPI）抑制MMPs活性以期改善肿瘤微环境，提高a-CTLA-4治疗效果。本实验使用小鼠乳腺癌高转移细胞系4T1，皮下接种于雌性BALB/c小鼠右后背部，构建乳腺癌模型，荷瘤小鼠分成四组：vehicle组、a-CTLA-4组、MMPI组及a-CTLA-4+MMPI组，接种后第3天开始给药至第42天。应用游标卡尺和小动物超声监测肿瘤生长；治疗结束后应用波恩氏固定液固定肺组织后观察并计数肺表面转移灶，同时显微镜下计数肝脏和肺脏转移灶数目；采用生化分析仪检测小鼠的肝肾功能；采用流式细胞术对小鼠脾脏内免疫细胞亚型包括CD4+T、CD8+T细胞、髓源性抑制细胞（MDSCs）和调节性T细胞（Treg）以及骨髓内MDSCs进行检测；应用免疫荧光法检测肿瘤组织内上述免疫细胞亚型的浸润；应用免疫组化检测肿瘤组织内微血管密度。实验结果如下：一、MMPs抑制剂对CTLA-4抗体治疗小鼠乳腺癌生长和转移的影响 1.荷瘤小鼠乳腺癌生长情况：与vehicle组比较，单用a-CTLA-4、单用MMPI及a-CTLA-4+MMPI对小鼠移植瘤的生长均具有不同程度的抑制作用。其中a-CTLA-4+MMPI组与vehicle组及MMPI组比较均具有统计学意义（P0.05）；而单用a-CTLA-4及MMPI与vehicle比较无统计学意义（P0.05）。 2.荷瘤小鼠乳腺癌转移情况：肉眼观察各组小鼠肺组织都有大小数量不等的肿瘤转移灶。统计结果显示，a-CTLA-4+MMPI组与vehicle组比较，荷瘤小鼠肺表面转移灶数目明显减少（P0.05）；而单用a-CTLA-4及单用MMPI与vehicle比较无统计学意义（P0.05）。显微镜下观察并计数肝脏和肺脏转移灶数目。统计结果显示，a-CTLA-4+MMPI与vehicle比较，肝脏及肺脏转移灶数目明显减少（P0.001）；而单用a-CTLA-4与vehicle比较均无统计学差异（P0.05）。 3.小鼠肝肾功能检测：荷瘤小鼠肝肾功能指标与正常小鼠比较均无统计学意义（P0.05）。二、MMPs抑制剂对CTLA-4抗体治疗小鼠乳腺癌免疫学指标的影响 1.免疫效应细胞CD4+T和CD8+T细胞以及两者的比值：与vehicle组及单独给药组比较，a-CTLA-4+MMPI组内荷瘤小鼠脾脏内CD4+T和CD8+T细胞百分比无明显改变。与vehicle组比较，单给药组及a-CTLA-4+MMPI组内荷瘤小鼠脾脏中CD8+T/CD4+T都有所提高，其中MMPI组与vehicle组比较有统计学差异（P0.05）。 2.免疫抑制细胞MDSCs、Treg细胞和免疫抑制相关细胞Th17以及Treg/Th17：a-CTLA-4组与vehicle组比较，荷瘤小鼠脾脏内Treg细胞、MDSCs和骨髓内MDSCs百分比以及Treg/Th17有所下降，但无统计学意义（P0.05），但是a-CTLA-4+MMPI组与vehicle组比较前述指标有统计学意义（P0.05）。a-CTLA-4+MMPI组与vehicle组比较Th17有所下降，但无统计学意义（P0.05）。三、MMPs抑制剂对CTLA-4抗体治疗小鼠乳腺癌肿瘤微环境的影响 1.免疫效应细胞CD4+T和CD8+T细胞以及两者的比值：与vehicle组和a-CTLA-4组比较，a-CTLA-4+MMPI组肿瘤组织内浸润的CD4+T、CD8+T细胞百分比增多，CD8+T/CD4+T有所提高。其中，a-CTLA-4+MMPI组与a-CTLA-4组比较，CD8+T/CD4+T有统计学意义（P0.05）。2.免疫抑制细胞Treg细胞、MDSCs和相关细胞Th17以及Treg/Th17：与vehicle组比较，a-CTLA-4+MMPI组内荷瘤小鼠肿瘤组织中MDSCs、Th17及Treg细胞百分比下降明显，有统计学意义（P0.05）。与vehicle组比较，a-CTLA-4+MMPI组及单用药组内荷瘤小鼠肿瘤组织中Treg/Th17略有下降，但无统计学意义（P0.05） 3.肿瘤间质内微血管密度：与vehicle组比较，单独使用a-CTLA-4荷瘤小鼠肿瘤组织内MVD值有所下降，但无统计学意义（P0.05）；而a-CTLA-4+MMPI组与vehicle组比较有统计学意义（P0.01）；a-CTLA-4+MMPI组与MMPI组比较有统计学意义（P0.05）。 4.肿瘤间质内微血管密度与免疫细胞相关性分析：Spearman相关性分析显示，肿瘤内浸润CD8+T和CD4+T细胞百分比以及CD8+T/CD4+T与MVD呈负相关，相关系数分别为-0.800、-0.800以及-0.100，无统计学意义。荷瘤小鼠肿瘤组织内Treg细胞、Th17和MDSCs百分比以及Treg/Th17与MVD呈正相关，相关系数分别为0.400、0.800、0.800以及0.400。其中，MDSCs与MVD相关性有统计学意义（P0.05）。结论： 1. MMPs抑制剂提高了CTLA-4抗体对小鼠乳腺癌的治疗效果，包括抑制肿瘤的生长和减少转移灶的形成。 2.与单独使用CTLA-4抗体治疗小鼠乳腺癌比较，联合CTLA-4抗体及MMPs抑制剂，荷瘤小鼠脾脏内免疫抑制细胞MDSCs和Treg细胞百分比显著下降，免疫效应细胞CD4+T细胞、CD8+T细胞百分比以及CD8+T细胞与CD4+T细胞比值均有所增加。 3.与单独使用CTLA-4抗体治疗小鼠乳腺癌比较，联合CTLA-4抗体及MMPs抑制剂明显抑制了肿瘤微环境内MDSCs、Th17以及Treg细胞的浸润；显著降低了肿瘤微环境内微血管密度。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R737.9
【部分图文】：

生长曲线,生长曲线,肿瘤转移,小动物

3.1.1 荷瘤小鼠乳腺癌生长情况监测为方便监测肿瘤生长情况，此次实验采用皮下接种的方法构建乳腺癌模型文献报道，4T1 细胞按 1×106/只接种后 42 天是观察肿瘤转移的最佳时机[41]。根据预实验结果 4T1 于接种第 3 天成瘤，因此，此次药物治疗周期选择第 3 天到第 42 天。于接种 4T1 后每隔 3 天应用游标卡尺测量肿瘤长径和短径，计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线，采用小动物超声于接种第 7、21、35 天监测肿瘤生长情况。实验结果显示：与对照组比较，单用 a-CTLA-4、单用 MMPI 及 a-CTLA-4MMPI 对小鼠移植瘤的生长均具有不同程度的抑制作用。其中 a-CTLA-4+ MMP与vehicle及MMPI组比较均具有统计学意义（P<0.05）；单用a-CTLA-4及MMP与 vehicle 比较无统计学意义（P>0.05）（图 3.1，图 3.2）。

分布情况,超声监测,小动物,乳腺癌

15图 3.2 小动物超声监测乳腺癌生长A. vehicle B.MMPI C.a-CTLA-4 D. a-CTLA-4+ MMPI3.1.2 荷瘤小鼠乳腺癌转移情况检测为确认移植瘤小鼠体内转移灶分布情况，分别取各组小鼠肺脏，用波恩氏固定液固定 48h，取肺脏组织和经 10%福尔马林固定的肝脏，制成石蜡切片后进行 HE 染色，根据文献报道方法计数肺脏表面及显微镜下肺脏和肝脏组织内

荷瘤小鼠,肺组织,箭头,肺脏

第 3 章结果[42]。结果显示：各组肺脏表面均可见大小数量不等的淡黄色结节(图 3.3)。统计结果表明：a-CTLA-4 +MMPI 与 vehicle 比较，肺脏目明显减少，有统计学意义（P<0.05）；而单用 a-CTLA-4 及单用cle 比较均无显著性意义（P>0.05）(图 3.4)。显微镜下观察各组小组织内均可见不同数量和大小的转移灶形成。统计学分析-4 +MMPI 与 vehicle 比较，肝脏及肺脏内转移灶数目明001）；而单用 a-CTLA-4 与 vehicle 比较均无统计学差异（P>0 3.6，图 3.7，图 3.8）。

【参考文献】