靶向MC1R重组毒素高效表达纯化、抗黑色素瘤活性及相关靶向信号分析

发布时间：2020-09-20 20:28

　　恶性黑色素瘤(MM)是始发于黑色素细胞的高度恶性肿瘤,特点为快速发生,易发生远处转移,预后差,是欧美浅肤色人种等国家皮肤癌死亡的首要原因。最常见的亚洲人群原发皮肤黑色素瘤主要为肢端黑色素瘤,约占全部黑色素瘤50%左右,上肢主要在手指末端及甲下,下肢主要在足趾和足底等部位。据统计,世界黑色素瘤每年的发病率以3%~8%的比例增多;黑色素瘤在我国发病率虽然在肿瘤中的比重较小,但总体为上升趋势,新发病例每年约有2万例,也是严重影响我国人民的生命健康病种之一,因此,对于晚期或扩散性黑色素瘤的针对性治疗和早期诊断显得尤为关键。目前治疗黑色素瘤的最佳手段仍是以手术为主,但术后仍有复发和转移的风险。在一些黑色素瘤晚期或不宜手术的患者,选择其他适宜的治疗方式十分必要;由于黑色素瘤对放射、化学疗法不敏感,使这些疗法的临床有效治疗率低,不能够有效延长患者的生存率,而且这些治疗方法对患者的免疫系统损伤较重。生物免疫治疗如黑色素瘤疫苗等,多数还处于研发或临床试验阶段,远期治疗效果还需进一步研究。近些年,靶向治疗开辟了肿瘤治疗的新方向,并有望成为黑色素瘤治疗的主导方法。对于黑色素瘤诊断包括查体、活检、影像学检查及实验室检查等,但目前仍无特异的肿瘤标志物,使其精确诊断受到了一定的限制。靶向药物无论在临床试验还是未来临床治疗中都需要靶向诊断方法进行病例筛选,只有确定适用病例后治疗才有意义。靶向诊断方法的建立首先就要获得靶向标志物。本研究以促黑色素细胞激素(α-MSH)作为引导结构与已经优化了密码子的绿脓杆菌外毒素蛋白相结合,成功构建一种高表达、特异性强的靶向MC1R(Melanocortin 1 Receptor)的重组毒素,并进行了基因工程菌株发酵与纯化研究;通过细胞毒性试验及动物模型试验来分析重组毒素的成药性评价,分析不同细胞MC1R的表达量及其与重组毒素有效性之间的关系,为重组毒素在临床上准确治疗及个体化治疗提供指导。通过生物信息学预测并证明了TCEAL7与miRNA-758的表达关系密切,同时通过调节TCEAL7来研究miRNA-758与黑色素瘤潜在联系,也证明了TCEAL7在黑色素瘤发生发展中起着重要作用,miR-758/TCEAL7可能作为黑色素瘤新诊断的标志物和治疗靶点。为了进一步获得更高表达量的重组毒素以便于能够工业化生产,我们将实验室保存的PE40毒素氨基酸序列,截短降低免疫原性,通过基因修饰将PE毒素羧基端的REDLK转变为KDEL多肽序列,增加活性。通过生物软件的分析及PE优化大肠杆菌嗜好密码子,合成PE38KDEL,以柔性linker将其与a-MSH基因连接,获得新构建的a-MSH-PE38_(KDEL)基因克隆。将重组毒素基因转入pET-30a载体,重组质粒pET-30a/a-MSH-PE38_(KDEL)载体成功构建,通过测序验证序列。将重组质粒转化到Rosseta(DE3)感受态受体菌株中,经卡那霉素抗性筛选后,以PCR及DNA测序验证。对鉴定阳性克隆菌株保种后以LB培养基发酵、IPTG诱导,经电泳基因水平分析和蛋白水平鉴定表达产物,层析扫描确定a-MSH-PE38_(KDEL)重组蛋白的表达量占全菌总蛋白的35%以上。利用Western blot对超声破碎后菌体进行分析,证明融合蛋白以有活性的可溶性表达产物、不直接表现活性的包涵体表达产物两种形式存在。对重组蛋白a-MSH-PE38_(KDEL)的可溶性表达采取粗略纯化与精细纯化相结合的工艺方式进行纯化。首先采用盐析法的硫酸铵沉淀法初步去除大部分杂质,再以疏水层析及离子交换层析对重组蛋白沉淀物进行精细纯化,最后以凝胶过滤层析法脱盐和纯化,并对饱和硫酸铵沉淀和层析条件进行优化。对于重组蛋白a-MSH-PE38_(KDEL)包涵体采取复性方式纯化,对包涵体进行反复的变性、复性,对复性产物进行亲和层析。从纯化结果看,这两种纯化方式终纯度都较高,均可满足后续实验要求。以细胞杀伤活性分析重组毒素a-MSH-PE38_(KDEL)对MC1R受体结合竞争情况;流式细胞仪分析重组毒素是否能够诱发细胞凋亡;选取人A375细胞、鼠黑色素瘤细胞B16-F10进行体外生物活性实验,因为这些细胞高表达MC1R;并以低表达MC1R的人正常肝细胞LO2、人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人胆囊癌细胞GBC-SD、人胃癌细胞BGC-823作对照,验证重组毒素的靶向杀伤作用。实验结果证明a-MSH-PE38_(KDEL)确实是通过与MC1R结合后发挥毒性作用的,而其发挥毒性作用的机制之一就是内化进入肿瘤细胞内后诱导细胞凋亡。与目前上市的多数靶向药物对肿瘤细胞信号干扰等相比,本实验中的重组毒素针对的是肿瘤细胞表面受体标志,不易受到其他因素干扰,其效果可能要优于信号干扰药物。a-MSH-PE38_(KDEL)对人正常肝脏细胞L02无杀伤作用,对黑色素瘤细胞A375及B16-F10细胞的杀伤率为93%。进一步分析a-MSH-PE38_(KDEL)重组毒素的体内抗肿瘤活性,采取皮下接种B16-F10细胞悬液建立BALB/c鼠黑色素瘤模型,并用a-MSH-PE38_(KDEL)对荷瘤小鼠进行治疗,分析重组毒素的抑瘤效果、毒副作用以及获得安全性评价等。重组毒素治疗分高、中、低三组,治疗组BALB/c鼠的肿瘤生长缓慢、未发现转移;而其中以高剂量组治疗效果更为明显,肿瘤消失率为58.3%;长期给予高剂量重组毒素治疗后(50天),治疗组7只BALB/c鼠中有4只肿瘤完全消失。组织病理及电镜结果显示a-MSH-PE38_(KDEL)对BALB/c鼠无明显的毒副作用。MC1R在肿瘤细胞与正常细胞和组织中的分布差异表明其有可能作为检测或靶向治疗的靶标,我们初步建立了一种MC1R的检测方法。分别利用蛋白免疫印迹法和荧光定量PCR法对不同细胞表面上的MC1R定量检测,分析样本中MC1R的含量与a-MSH-PE38_(KDEL)有效性之间的关系。检测的12种细胞中,验证了B16-F10细胞中MC1R mRNA的高表达量,发现人结直肠癌细胞HT29和人食管癌细胞eca-109中MC1R mRNA的表达量较黑色素瘤细胞B16-F10要高3-5倍,HCT-116(人结直肠癌细胞)与B16-F10细胞的mRNA表达量接近,并且荧光定量PCR与蛋白免疫印迹法检测结果基本一致。说明a-MSH-PE38_(KDEL)除了MM细胞外可能具有更强的新的潜在肿瘤靶点。在很多肿瘤中能够见到人转录延长因子A(SII)-样7(TCEAL7)的异位表达,其中包括恶性黑色素瘤,但其功能并不明确。本实验通过Western blot和qPCR方法证明了TCEAL7在黑色素瘤组织及细胞系A375和WM-115中表达量较低;通过慢病毒感染上调了TCEAL7在A375和WM-115细胞系中的表达量;转染siRNA-TCEAL7下调TCEAL7的表达,CCK-8检测法来评估TCEAL7对黑色素瘤生长的影响;流式细胞仪来检测TCEAL7在细胞凋亡过程中的作用。结果表明下调TCEAL7表达量可促进细胞增殖、肿瘤发生及抑制黑色素瘤凋亡。4周龄雌性BALB/c裸鼠,分别在裸鼠背侧皮下注射含有1×10~7转染siRNA和慢病毒感染后的A375和WM-115细胞。结果显示上调TCEAL7的表达量会抑制肿瘤的发生,下调时则会促进其生长。根据生物信息学分析结果表明miRNA-758的表达量与TCEAL7关系密切,通过qPCR证明转染mimics-miR-758的黑色素瘤细胞A375和WM-115中miRNA-758过表达,而Western blot却显示TCEAL7为低表达;双荧光素酶报告基因实验结果表明,在黑色素瘤A375和WM-115细胞上调表达miR-758后,TCEAL7的转录活性受到抑制。进一步分析了miR-758的异位表达在恶性黑色素瘤发展中的作用。WM-115和A375细胞转染mimics-miR-758的CCK-8检测结果显示,该基因能够促进细胞增殖能力;而基于mimics-miR-758过表达TCEAL7时,对细胞增殖的作用被削弱了。并且,当WM-115和A375细胞转染mimics-miR-758后,细胞凋亡被抑制;而基于mimics-miR-758过表达TCEAL7时,这种被过表达miR-758诱导的促细胞凋亡作用亦被抑制。上述结果表明,TCEAL7为黑色素瘤的一种抑癌基因,可抑制黑色素瘤的发生发展;miRNA-758为TCEAL7的上游调控因子,可通过下调TCEAL7表达水平,来发挥促癌作用。总之,本试验通过PE40密码子优化,将基因工程菌株目的蛋白a-MSH-PE38_(KDEL)的表达量从出发株原来的10%提高到现在的35%~40%;确定了实验室规模的a-MSH-PE38_(KDEL)可溶性和包涵体表达产物的纯化工艺,获得纯度超过95%以上的重组毒素产品;通过细胞水平试验明确靶向肿瘤细胞系,同时确定了使用剂量,为动物试验提供基础数据;通过黑色素瘤动物模型治疗试验明确了靶向黑色素瘤的强效杀伤作用,重组毒素能够快速消除鼠体内的黑色素瘤,临床观察、病理组织学切片和电子显微镜超微结构观察未见明显异常,证明其安全性好,是一种非常有前景的黑色素瘤的候选靶向药物;明显优于达卡巴嗪和顺铂化疗药治疗效果,观察到化疗药物治疗组中存在超微结构病理变化;细胞靶向筛选中发现了重组毒素的新肿瘤靶标:人结肠癌细胞系HT29和人食管癌细胞eca-109,而且靶向杀伤作用比黑色素瘤细胞B16-F10还要强几倍;通过黑色素瘤临床样本分析,认为miR-758/TCEAL7可能作为一个新的潜在诊断标志物和治疗靶标。希望本实验的结果能为未来的临床试验及黑色素瘤个性化治疗提供一定的参考。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R739.5
【部分图文】：

位置,恶性黑色素瘤,信号通路,抑癌基因

第一篇文献综述第 2 章恶性黑色素瘤靶向药物治疗13图2.1 黑色素瘤细胞常见发生在皮肤上的位置Fig.2.1 The location of a melanoma cell commonly occurring on the skin2.1 针对恶性黑色素瘤主要特异信号通路的靶向治疗MM发病机制在一定程度上取决于黑色素细胞DNA突变导致相关癌基因被激活或抑癌基因失活，反过来导致染色体异常，最终诱发恶性黑色素瘤发生。过度阳光照射可能是诱因之一，特别是白色人种。有黑色素瘤家族史的患者约40%带有CDKN2A基因，该类基因受损时导致抑癌基因（如RB，p53）功能受损[74-76]。MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）通路失调是大部分黑色素瘤特征之一，该信号通路是由RAS→RAF→MEK→ERK等蛋白激酶组成，这种信号通路通过瀑布效应依次催化下级蛋白激酶而完成活化，可被细胞外多种信号因子激活，进而诱导细胞恶性变化

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吉林大学博士学位论文14图2.2 黑色素瘤易基因突变的信号通路及基因Fig.2.2 The signal pathway and gene mutations of melanoma现在开发的多种靶向黑色素瘤药物就是针对其中的某个信号蛋白来干扰其进一步传递过程，从而达到治疗目的。2.1.1 BRAF 抑制剂（1）维罗菲尼就在几年前晚期黑色素瘤或转移性黑色素瘤主要依靠化学药物治疗，应答率不超过10%，患者预后很差。美国FDA在2011年批准BRAFV600E突变抑制剂维罗菲尼（vemurafenib/Zelboraf/PLX4032)上市，靶向新药研发获得了重要突破。以往经研究发现约有50%的进展型MM有BRAFV600E变异发生，在突变的病例中维罗菲尼的反应率达到了50%，比化学药物治疗延长至少3个月以上的生存期。维罗菲尼当时被认为是黑色素瘤治疗所取得的最突出的进展，也是转移性黑色素瘤个性化治疗的比较理想的典范。但后来又出现了PD-1抑制剂甚至超过了一半应答率。维罗菲尼在半年左右开始出现耐药

黑色素瘤,信号通路,恶性黑色素瘤

第一篇文献综述第 2 章恶性黑色素瘤靶向药物治疗15图2.3 黑色素瘤相关的信号通路Fig.2.3 Major pathways involved in melanoma[78]. Pathways associated with cellproliferation, survival, and variation are figurely presented. Arrows show activatingsignals; interrupted lines, inhibiting signals. AMPK, AMP-activated protein kinase;Aurk, Aurora kinase; BAD, BCL-2 antagonist of cell death; CDK4, cyclin-dependentkinase 4; CDKN2A, cyclin-dependent kinase inhibitor of kinase 2A; ERK,extracellular-related kinase; HGF, hepatocyte growth factor; MITF,microphthalmia-associated transcription factor; MEK, mitogen-activated proteinkinase-extracellular-related kinase; PI3K, phosphatidylinositol 3 kinase; PTEN,phosphatase and tensin homolog; RB, retinoblastoma protein; TERT, telomerasereverse transcriptase.在恶性黑色素瘤或转移性黑色素瘤患者中，针对BRAFV600E常见突变和RAFV600K偶发突变，维罗菲尼都能明显改善患者状况并延长生存期。澳大利亚Peter MacCallum 肿瘤中心的 Grant A McArthur等对此种亚组病例扩大随访[79,80]。随访18岁以上患者、有BRAFV600变异但未经治疗的MM患者，曾经维罗菲尼抗瘤试验。随机将受试者分为2 组，一组为每日两次口服维罗菲尼960 mg治疗组，另一组按照1000 mg/m2体表面积每3周静脉注射一次达卡巴嗪。在12个国家总计包括104个研究分中心进行试验，包括675名受试者，实?

【参考文献】