沉默DDX43对增强司美替尼治疗肺腺癌疗效的研究
发布时间：2020-09-21 19:10
肺癌是全世界范围内肿瘤死亡的首要原因,80%-85%是非小细胞肺癌(Non-small-cell carcinoma,NSCLC),在我国非小细胞肺癌发病率也是逐年增加,其中以肺腺癌最多见。目前,肺腺癌的治疗方法主要包括手术切除、化疗、放疗以及生物治疗等,其中化疗是治疗中晚期肺腺癌患者的重要手段之一。但在临床治疗过程中许多中晚期患者疗效差,面对晚期肺腺癌患者临床上只有“含铂类药物化疗”这唯一支持治疗的方法,虽然它在一定程度上增加了患者的总生存期(Overall survival,OS),但它的上限也仅限于20%的反应率或/和8-10月的中位生存期,主要原因就是肿瘤细胞增殖过快、侵袭性强和/或出现化疗药物耐药。究其原因就是关键的驱动基因例如:EGFR、KRAS、HER-2、PIK3CA、BRAF,MET的突变,其中KRAS基因会持续的刺激细胞生长,并阻止细胞死亡,从而导致肿瘤的发生,伴有KRAS基因突变的肺腺癌患者会有更高的复发和转移的机率。所以KRAS基因是目前确认的肿瘤靶向治疗药物的重要基因标记之一,目前临床上给予KRAS基因无突变的患者西妥昔单抗和贝伐珠单抗有关靶向治疗药物,能获得明显的治疗效果,而KRAS基因突变的患者还未有好的靶向药物治疗。DEAD 盒多肽 43(DEAD(Asp-—Glu-Ala—Asp)box polypeptide 43,DDX43]是最初在人横纹肌肉瘤LB23-SAR细胞株中鉴定的一种肿瘤特异性基因,DDX43基因位于染色体6q12-13,由648个氨基酸组成,全长2 300bp,主要定位于细胞质。研究揭示,DDX43基因通过调节KRAS信号转导通路在细胞增殖、恶性转化、肿瘤侵袭、肿瘤免疫及肿瘤耐药等方面起重要作用,并且高表达于多种类型肿瘤中。司美替尼是一种小分子MEK1/MEK2抑制剂(分裂原活化抑制剂),在临床上逐渐被用于治疗非小细胞肺癌,司美替尼下调KRAS、临床证据表明在KRAS突变的肺非小细胞癌还不存在靶向治疗,而临床上患者采用司美替尼联合多烯紫杉醇能产生增效作用。小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)是近些年来发现的一种重要的基因表达调控方式,它可由内源产生或有由人为的转染进入沉默RNA(silencing RNA),它可以特异的剔除或关闭基因的表达,因此在医学上用途广泛。目前已知siRNA是以带有专一性的方式来调节基因的表达,从而参与RNA干扰现象。此外,siRNA利用多种不同的转染技术可以导入靶细胞内,从而达到对指定的目标基因产生独有的敲弱效果。因此可利用这种技术来对已知序列的基因进行标定和沉默,这种技术的运用使siRNA成为研究基因功能或/和目标药物的一种重要的技术方法和手段。本实验研究拟通过研究DDX43在肺腺癌组织、细胞中的表达以及沉默DDX43肺腺癌细胞中DDX43的表达情况,体内外观察DDX43基因沉默后司美替尼对肺腺癌化疗敏感性的影响,为临床上对于KRAS突变的肺腺癌患者寻找靶向药物以及增强司美替尼化疗敏感性奠定理论上基础。本研究共分以下四个部分。第一部分DDX43在肺腺癌组织中的表达及其意义方法1.分别针对正常肺组织(62例)、肺泡上皮不典型增生组织(31例)及肺腺癌组织标本(62例)利用免疫组织化学SP法、蛋白质免疫印迹法(Western blot)、RT-PCR、荧光原位杂交技术检测DDX43蛋白水平及mRNA水平表达情况。2.统计学方法:数据采用软件SPSS19.0进行处理。计数资料采用χ2检验、计量资料行t检验或方差分析,及Spearman进行相关性分析,检验水准α=0.05。结果1.免疫组化SP法:DDX43蛋白阳性表达呈棕黄色颗粒;荧光原位杂交:DDX43 mRNA阳性表达单标呈绿色信号;两者均定位于肺腺癌细胞的胞质内;在正常肺组织及肺泡不典型增生组织内蛋白和mRNA表达水平呈现阴性表达低表达。2.在正常肺组织、肺泡不典型增生和肺腺癌组织中,通过免疫组化、Western blot联合检测显示:DDX43蛋白水平阳性表达率依次升高,三者间两两相比差异均有统计学意义(P0.05);在正常肺组织、肺泡不典型增生和肺腺癌组织中,通过RT-PCR、荧光原位杂交联合检测显示:DDX43mRNA表达水平亦依次升高,三者间两两相比差异均有统计学意义(P0.05)。3.不同肺腺癌病理亚型中,DDX43蛋白、mRNA的表达无明显差别(P0.05)。4.DDX43蛋白、mRNA的表达在有淋巴结转移组的肺腺癌组织中显著高于无淋巴结转移组,两组相比差异有统计学意义(P0.05)。5.DDX43蛋白、mRNA的表达在有胸膜侵犯组的肺腺癌组织中显著高于无胸膜侵犯组,两组相比差异有统计学意义(P0.05)。6 DDX43蛋白、mRNA的表达在有脉管侵犯组的肺腺癌组织中显著高于无脉管侵犯组,两组相比差异有统计学意义(P0.05)。7.DDX43蛋白、mRNA的表达均与肺腺癌患者的年龄、性别无关(P0.05)。第二部分DDX43 siRNA表达载体的构建方法1.构建重组载体 pSilencer3.1-DDX43siRNA。2.设立1个阴性对照siRNA载体和已构建好的3个DDX43siRNA载体均分别转染肺腺癌细胞A549细胞株,并获得稳定的细胞株。3.应用Western blot方法检测A549细胞中DDX43蛋白的相对表达量;采用实时荧光定量PCR技术检测A549细胞中DDX43 mRNA的相对表达量,从而选出抑制效果最好DDX43siRNA。4.统计学处理:数据采用软件SPSS19.0进行处理,计数资料采用χ2检验、计量资料行t检验或方差分析。检验水准α=0.05。结果1.成功构建了pSilencer3.1-DDX43siRNA1、pSilencer3.1-DDX43siRNA2及 pSilencer 3.1-DDX43siRNA3 重组载体。2.DDX43siRNAl、DDX43siRNA2 和 DDX43siRNA3 重组载体分别转染肺腺癌A549细胞后,DDX43蛋白和mRNA的表达水平均显著低于未处理的A549细胞组和siRNA对照组(P0.05)。3.三个DDX43siRNA载体,组间两两相比,DDX43mRNA表达在DDX43siRNAl 和 DDX43siRNA3 之间无差异(P0.05);DDX43siRNA2 组中DDX43 mRNA的表达水平显著低于DDX43siRNAl和DDX43siRNA3(P0.05)。第三部分DDX43siRNA干扰表达载体体外对司美替尼抑制肺腺癌A549细胞增殖、诱导其凋亡的影响方法1分组培养肺腺癌A549细胞株,A组:正常对照组,A549细胞株未经过任何处理;B组:DDX43siRNA2+司美替尼组,载体DDX43siRNA2转染24h肺腺癌A549细胞后,接着用10μmol/L司美替尼处理A549细胞12h;C组:司美替尼组,10μmol/L Selumetinib培养A549持续 12h。2.使用免疫印迹蛋白(Westernblot)、免疫细胞化学检测各实验组细胞中的DDX43蛋白表达情况;采用原位杂交、RT-PCR方法检测各实验组细胞中的DDX43mRNA 的表达。3.运用流式细胞仪、MTT和TUNEL方法检测各实验组A549细胞凋亡和增殖情况。4.统计学处理:在具体的处理程序内使用SPSS19.0软件,使用χ2检验、方差分析或者是t检验,实际的检验水准被确定为α = 0.05。结果1.免疫细胞化学及Western blot检测结果:A组(正常对照组)和C组(司美替尼组)与B组(DDX43siRNA2+司美替尼组)相比,肺腺癌A549细胞中DDX43蛋白表达不断的下降,两方面的要素对比,其中的区别存在对应的统计学价值(P0.05)。2.原位杂交及RT-PCR检测结果:A组(正常对照组)和C组(司美替尼组)与B组(DDX43siRNA2+司美替尼组)相比,肺腺癌A549细胞中DDX43mRNA表达明显上调,组间两两相比差异均有统计学意义(P0.05)。3.MTT法检测结果:A组(正常对照组)和C组(司美替尼组)与B组(DDX43siRNA2+司美替尼组)比较,A549细胞生长抑制率明显增加,差异具有统计学意义(P0.05)。4.流式细胞技术及TUNEL检测A549细胞凋亡的结果:A组(正常对照组)和C组(司美替尼组)与B组(DDX43siRNA2+司美替尼组)相比,凋亡细胞数显著逐渐增加,且差异均有统计学意义(P0.05)。第四部分DDX43siRNA干扰表达载体体内对司美替尼诱导的肺腺癌移植瘤细胞生物学行为的影响方法1.构建肺腺癌裸鼠移植瘤模型。2.分组饲养带瘤裸鼠,A组:正常对照组,瘤体内注射无菌生理盐水;B组:DDX43 siRNA2+司美替尼组,瘤体内注射DDX43 siRNA2及司美替尼(浓度:5mg/Kg);C组:司美替尼组,瘤体内注射司美替尼(浓度5mg/Kg)。各实验组:3day/注射一次,共注射6次。3.观察和记录各实验组裸鼠移植瘤的生长状况,并绘制生长曲线。4.采用免疫组化、Western blot方法检测各实验组移植瘤组织中DDX43蛋白表达情况;5.运用荧光原位杂交、RT-PCR方法检测各实验组移植瘤组织中DDX43 mRNA的表达情况。6.采用TUNEL法检测各实验组肿瘤细胞的凋亡情况。7.统计学处理:应用SPSS19.0软件处理,计数资料采用χ2检验、计量资料行t检验或方差分析,检验水准α=0.05。结果1.A组(正常对照组)和C组(司美替尼组)的移植瘤体积显著大于B组(DDX43siRNA2+司美替尼组),组间两两相比,差异均有统计学意义(P0.05)。2.免疫组化和Western blot检测蛋白的结果:A组(正常对照组)和C组(司美替尼组)的裸鼠移植瘤组织中DDX43蛋白表达明显高于B组(DDX43 siRNA2+司美替尼组),组间两两相比,差异均有统计学意义(P0.05)。3.荧光原位杂交及RT-PCR检测mRNA结果:A组(正常对照组)和C组(司美替尼组)的裸鼠移植瘤组织中DDX43 mRNA表达明显高于B组(DDX43 siRNA2+司美替尼组),组间两两相比,差异均有统计学意义(P0.05)。4.TUNEL法检测凋亡的结果:A组(正常对照组)和C组(司美替尼组)细胞中凋亡指数(AI)显著低于B组(DDX43 siRNA2+司美替尼组),组间两两相比差异均有统计学意义(P0.05)。全文结论1.DDX43在肺腺癌组织中高表达。2.肺腺癌发生发展和浸润转移均与DDX43蛋白和mRNA表达有关。3.构建好的载体中,成功筛选具有最好抑制效果的载体是DDX43siRNA2。4.人肺腺癌癌A549细胞转染DDX43 siRNA干扰表达载体后,细胞中DDX43蛋白和mRNA的表达均下调。5.沉默DDX43后联合司美替尼可体外促进肺腺癌A549细胞凋亡,增强司美替尼抑制肺腺癌A549细胞增殖。6.沉默DDX43后联合司美替尼可体内促进移植瘤细胞凋亡,增强司美替尼对肺腺癌裸鼠移植瘤生长抑制。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R734.2
【部分图文】：
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本文编号：2823881
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R734.2
【部分图文】：
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