HIF-1α和ARK5对结直肠癌生物学行为的影响及相关机制的研究

发布时间：2020-09-22 13:19

　　背景:结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一,临床上主要表现为高发病率、高转移率、高死亡率。现代医学的进步已经极大改善了结直肠癌患者的预后,尽管如此结直肠癌患者的术后复发率、死亡率依然居高不下。造成上述情况的主要原因即是结直肠癌的复发和转移。所以,寻找能够预测和诊断结直肠癌的分子标志物是对抗肿瘤复发、转移的分子基础,对于临床治疗、提高患者的生存期和改善预后具有十分重要的意义。在细胞和分子水平上,有多种因素共同参与肿瘤的恶变、转移、侵袭等病理过程。近几年的研究发现,缺氧是导致恶性肿瘤发生和发展的共同特点。缺氧诱导因子-lα(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)是目前发现的唯一一种在特异性缺氧环境下仍具有生物学活性的转录因子。肿瘤细胞生长失控导致肿瘤组织异常过快增生,这必将引起局部组织严重缺氧,同时供能与耗能之间的平衡被打破。上述过程诱导了 HIF-1α的表达,随后HIF-1α进一步促进其靶基因的转录,因此肿瘤组织供血、供氧以及供能增加,最终促使肿瘤细胞对缺氧微环境产生适应性。HIF-1α通过复杂的信号转导机制参与肿瘤发展的多个阶段的调控,在肿瘤的发生发展过程中起重要作用。目前已证实HIF-1α在多种不同来源的恶性肿瘤组织中均有表达,其与肿瘤恶性化进程之间的相关性也已成为近几年肿瘤医学界研究的重点和热点内容。AMPK相关蛋白激酶5(AMPK-relαted protein kinαse 5,ARK5)也被称为NUAK1,为Akt下游重要的信号分子。研究显示,ARK5活化诱导肿瘤抑制因子ATM磷酸化,进而磷酸化其下游基因p53而使其丧失生物学活性,最终导致基因表达异常、肿瘤形成。目前已有研究证实,在人类多种恶性肿瘤中均检测到了 ARK5的异常表达。近几年来,HIF-1α和ARK5在肿瘤组织中的异常表达逐渐为广大医学工作者所重视。两者在多种肿瘤组织中存在异常表达,且与肿瘤的生长、浸润以及转移密切相关,在部分肿瘤的诊断分型以及预后判断等方面具有一定的价值。但目前关于HIF-1α和ARK5在结直肠癌中表达意义及相关分子生物学机制尚不十分清楚,需进一步探索研究。目的:本研究拟检测HIF-1α和ARK5在结直肠癌患者组织中的表达,分析HIF-1α基因沉默后对结直肠癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移以及ARK5表达的影响,探究HIF-1α在体内对裸鼠移植瘤生长的影响,旨在了解HIF-1α通过调控ARK5促进结直肠癌发生和发展的机制,并为结直肠癌的临床诊断以及靶向治疗提供理论依据。方法:1、采集60例2014年9月至2015年9月武汉大学人民医院普通外科接受手术治疗的结直肠癌患者的癌组织样本以及相应癌旁正常组织样本。分别采用实时荧光定量PCR、Western blot法和免疫组化等技术检测上述组织中HIF-1α和ARK5 mRNA和蛋白的表达,分析HIF-1α和ARK5表达与结直肠癌患者年龄、性别、TNM分期、病理分化程度、淋巴结转移、以及肝转移的关系,分析HIF-1α与ARK5在结直肠癌组织中表达的相关性。2、采用常氧和加入100μmol/LCoCl2(缺氧)的方法培养人结肠癌SW480细胞,检测细胞中HIF-1α和ARK5 mRNA的的表达。将SW480随机分为3组,control 组:细胞加入 100 μmol/L 的 CoC12,制备缺氧模型;si-control 组:将 siHIF-1α的对照质粒si-control转染细胞,随后向细胞中加入100umol/L的CoC12;siHIF-1α组:将siHIF-1α转染细胞,随后向细胞中加入100umol/l的CoC12,检测上述各组细胞中HIF-1α和ARK5 mRNA的表达。检测各组细胞的增值活性(CCK-8法)、细胞凋亡率(流式细胞术)、细胞侵袭能力(Trαnswell法)、细胞迁移能力(细胞划痕实验)。3、采用人结肠癌细胞株SW480接种裸鼠右肩胛皮下,建立裸鼠结肠癌SW480细胞移植瘤模型,观察成瘤情况。将裸鼠随机分为3组,control组:细胞常规培养,不进行任何处理,随后接种于裸鼠皮下;si-control组:细胞转染si-control质粒,随后接种于裸鼠皮下;siHIF-1α组:将siHIF-1α转染细胞,随后接种于裸鼠皮下。每隔5天,游标卡尺测量移植瘤的长度(L)、宽度(W),计算移植瘤体积,于第20天将裸鼠处死并采集完整的移植瘤组织,称取重量。采用Western blot法检测移植瘤组织中ARK5蛋白的表达。结果:1、与癌旁组织相比,结直肠癌组织中ARK5和HIF-1α mRNA和蛋白水平的表达均显著增高(P0.05)。HIF-1α和ARK5蛋白主要在细胞浆和细胞核中表达。在60例结肠癌组织中,HIF-1α和ARK5蛋白的阳性表达率分别为76.7%(46/60)和71.7%(43/60)。单因素分析结果显示,HIF-1α和ARK5蛋白的表达与肿瘤分期(分别为73.9%和74.4%)、病理分化程度(分别为78.3%和81.4%)、淋巴结转移(分别为82.6%和79.1%)和肝癌转移(分别为32.6%和30.2%)有关。线性相关分析评估HIF-1α和ARK5表达的关系,结果显示两者之间存在相关性(r = 0.776,P = 0.001)。2、与常氧组相比,缺氧组细胞中ARK5和HIF-1αmRNA的表达水平均显著增高(P0.05)。与 si-control 组相比,siHIF-1α组细胞中 ARK5 和 HIF-1α mRNA的表达水平显著下降(P0.05)。上述研究结果表明,HIF-1α基因沉默的结直肠癌细胞系构建成功,可用于后续实验。同时,HIF-1α敲减后ARK5mRNA的表达量也随之降低,提示ARK5可能为HIF-1α的下游因子,其表达受HIF-1α的调控。control组与si-control组细胞的增殖活性无统计学差异(P0.05);与si-control组相比,siHIF-1α组细胞的增殖活性显著下降(P0.05)。control组与si-control组细胞凋亡率无统计学差异(P0.05);与si-control组相比,siHIF-1α组细胞的凋亡率显著增高(P0.05)。control组与si-control组侵袭细胞数无统计学差异(P0.05);与 si-control 组相比,siHIF-1α组侵袭细胞数显著减少(P0.05)。control组与si-control组细胞迁移率无统计学差异(P0.05);与si-control组相比,siHIF-1α组细胞迁移率显著降低(P0.05)。3、在裸鼠移植成瘤后,各组裸鼠的饮食、活动、两便、肤色均正常,移植瘤组织未发生破溃。与control组相比,si-control组裸鼠移植瘤体积在各时间点均无显著差异(P0.05);与si-control组相比,siHIF-1α组裸鼠移植瘤体积在各时间点均显著减小(P0.05)。control组相比,si-control组裸鼠移植瘤重量无统计学差异(P0.05);与si-control组相比,siHIF-1α组裸鼠移植瘤重量显著减小(P0.05)。与control组相比,si-control组裸鼠移植瘤组织中ARK5蛋白的表达无统计学差异(P0.05);与si-control组相比,siHIF-1α组裸鼠移植瘤组织中ARK5蛋白的表达明显降低(P0.05)。结论:1、HIF-1α和ARK5在结直肠癌组织的表达水平发生异常上调,其阳性表达率与患者的TNM分期、病理分化程度、淋巴结转移和肝转移有关,且HIF-1α与ARK5之间存在正相关。2、缺氧环境能够使人结肠癌SW480细胞中HIF-1α和ARK5mRNA的表达水平增高,HIF-1α通过上调ARK5促进缺氧条件下人结肠癌SW480细胞增殖、侵袭和迁移,抑制凋亡。3、沉默HIF-1α可有效抑制结肠癌细胞裸鼠移植瘤生长,其机制可能与HIF-1α表达抑制后ARK5的表达水平也随之下调有关。
【学位单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.34
【部分图文】：

结直肠癌,正常组织,质量,表达水平

为了邋了解结直肠癌组织中ＡＲＫ５和ＨＩＦ－ｌａｍＲＮＡ的表达水平，本研宄采用逡逑荧光定量ＰＣＲ分别检测了结直肠癌组织以及癌旁相应正常组织中ＡＲＫ５和逡逑ＨＩＦ－ｌａｍＲＮＡ的表达。结果显示（图１－２），与癌旁相应组织相比，结直肠癌组逡逑织中ＡＲＫ５和ＨＩＦ－ｌａ邋ｍＲＮＡ的表达水平明显增高，差异具有统计学意义逡逑（Ｐ＜０．０５）0逡逑＾邋＾逦Ｊ－逦■癌旁正常组织逡逑＜邋３－逦＊逦■结直肠癌组织逡逑｜邋ｉ逡逑Ｉ邋２＇逡逑Ｌ邋＿邋Ｉ邋＿邋Ｊ逡逑ｉＪａｉｉ邋ａｌ邋ｌ逡逑／邋／逡逑图１－２邋ＡＲＫ５和ＨＩＦ－ｌａ邋ｍＲＮＡ表达检测逡逑注：＊Ｐ为与癌旁正常组织相比，Ｐ＜0．0５逡逑１６逡逑

结直肠癌,正常组织,表达水平,统计学意义

１邋２逡逑图１－１琼脂糖凝胶电泳检测总ＲＮＡ质量逡逑注：１：结直肠癌组织；２：癌旁相应正常组织逡逑１．３．２邋ＡＲＫ５和ＨＩＦ－１邋ａ邋ｍＲＮＡ表达检测结果逡逑为了邋了解结直肠癌组织中ＡＲＫ５和ＨＩＦ－ｌａｍＲＮＡ的表达水平，本研宄采用逡逑荧光定量ＰＣＲ分别检测了结直肠癌组织以及癌旁相应正常组织中ＡＲＫ５和逡逑ＨＩＦ－ｌａｍＲＮＡ的表达。结果显示（图１－２），与癌旁相应组织相比，结直肠癌组逡逑织中ＡＲＫ５和ＨＩＦ－ｌａ邋ｍＲＮＡ的表达水平明显增高，差异具有统计学意义逡逑（Ｐ＜０．０５）0逡逑＾邋＾逦Ｊ－逦■癌旁正常组织逡逑＜邋３－逦＊逦■结直肠癌组织逡逑｜邋ｉ逡逑Ｉ邋２＇逡逑Ｌ邋＿邋Ｉ邋＿邋Ｊ逡逑ｉＪａｉｉ邋ａｌ邋ｌ逡逑／邋／逡逑图１－２邋ＡＲＫ５和ＨＩＦ－ｌａ邋ｍＲＮＡ表达检测逡逑注：＊Ｐ为与癌旁正常组织相比，Ｐ＜0．0５逡逑１６逡逑

结直肠癌,细胞核,正常组织,细胞浆

为评价结直肠癌组织中ＡＲ．Ｋ５和ＨＩＦ－ｌａ蛋白的表达，运用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ法分逡逑别检测结直肠癌组织和癌旁相应正常组织中ＡＲＫ５和ＨＩＦ－ｌａ蛋白的表达水平。逡逑结果显示（图１－３），与癌旁相应组织相比，结直肠癌组织中ＡＲＫ５和ＨＩＦ－ｌａ蛋逡逑白的表达水平明显增高，差异具有统计学意义（Ｐ＜0．0５）。逡逑癌旁正常组织结直肠癌组织逡逑ａｒｋｓ逡逑ＨＩＦ－ａ逡逑ｐ－ａｃｔｉｎ逡逑１邋５－｜逡逑怕逦■癌旁正常组织逡逑＊逦■■结直肠癌组织逡逑酬邋１．0＿逦＊逦ｒ＾ｎ逡逑0逦丁逡逑ｉ逡逑ｉ邋ｏ邋ｓ－逡逑ｉ邋ａ邋ｌ逡逑0．0Ｊ￣＾ｍ－ｒ１逦逦＾ｍ￣ｒＡ逦—逡逑／邋／逡逑图１－３邋ＡＲＫ５和ＨＩＦ－１邋ａ蛋白表达检测逡逑注：＊Ｐ为与癌旁正常组织相比，Ｐ＜0．0５逡逑１．３．４ＨＥ染色结果逡逑本研宄采用ＨＥ染色法分别对结直肠癌组织以及癌旁相应正常组织进行染逡逑色，用以观察两者之间的差异。结果显示（图１－４）：正常结直肠组织细胞的大小逡逑基本一致，形态基本相同，每个细胞内只有一个细胞核，细胞核与细胞浆呈一定逡逑比例。而癌细胞较正常结直肠细胞体积增大，大小不一致，形态不相同，部分细逡逑胞形成“瘤巨细胞”。细胞核体积亦增大且形态不相同，能够观察到呈双核、巨核、逡逑多核以及异形核等，细胞浆与细胞核之间的比例也不同于正常结直肠细胞。逡逑１７逡逑

【参考文献】