RIP3调控细胞自噬的分子机制及其与人结肠癌关系的研究

发布时间：2020-09-24 07:32

　　 结直肠癌(Colorectalcancer,CRC)是临床上最常见的消化系统恶性肿瘤之一,近些年来,随着人们生活水平不断提高和饮食习惯发生改变,结直肠癌的发病率呈明显上升趋势,严重威胁着人类健康。尽管以手术为主、放化疗为辅的传统治疗模式有了很大改进,但晚期结肠癌的治疗仍不满意,患者总体生存率并无显著提高。因此,寻找行之有效的其他疗法配合甚至取代手术治疗,对降低结直肠癌的复发率和病死率,提高其治愈率和改善患者的生活质量具有重要性。细胞自噬是一种细胞内自我降解的方式,是将细胞内受损、变形、衰老或失去功能的蛋白质以及细胞器运输到溶酶体,并进行消化和降解的过程。这一过程对细胞稳态维持是必需的,也是细胞抵御病原体的保护机制。细胞自噬与肿瘤的关系非常复杂,目前认为在肿瘤发生时细胞自噬起到抑制作用,但在肿瘤发展的进程中,细胞自噬又可能为肿瘤细胞提供对抗营养缺乏和缺氧的机制,促进肿瘤细胞的生存。细胞自噬是许多肿瘤抵御化疗药物的机制,但在某些情况下,细胞自噬在肿瘤细胞的抗癌药物介导的细胞死亡中发挥着促进细胞死亡的作用,促进细胞自噬性死亡却又是某些肿瘤治疗的有效手段。随着自噬研究现象的深入,自噬逐渐成为一个新的癌症治疗靶点。首先在人结肠癌细胞HT29中分别转染RIP3 shRNA干扰质粒和过表达质粒,用无糖培养液诱导细胞自噬,发现敲低RIP3后细胞自噬减弱,而过表达RIP3后细胞自噬增强。我们首次发现:RIP3能够促进人结肠癌细胞HT29的细胞自噬。接着,对RIP3调控人结肠癌细胞自噬的可能分子机制展开进一步的深入研究。首先,WesternBlotting结果显示葡萄糖饥饿诱导的HT29细胞自噬并不依赖于经典的mTOR信号途径。通过质谱研究发现,RIP3与结肠癌中可能参与细胞自噬的G蛋白GNAI3和G蛋白调节因子RGS19相互作用,用免疫共沉淀方法进一步验证了这一结果。我们推测RIP3可能通过与GNAI3和RGS19的相互作用介导了结肠癌的细胞自噬。尽管,RIP3敲低或过表达后,GNAI3和RGS19的表达量不发生改变,但是,研究结果发现GNAI3或RGS19的表达下调会抑制HT29细胞自噬,并且GNAI3的GTPase酶活性能够促进HT29细胞自噬。RIP3是一个丝氨酸/苏氨酸激酶,我们推测RIP3可能通过其激酶活性而影响了细胞自噬,通过将激酶活性点突变的RIP3表达质粒回补到RIP3敲低的细胞中,诱导细胞自噬后发现RIP3的激酶活性确实能够促进HT29细胞自噬,且其发挥作用的激酶活性中心为K50。体外激酶活性分析实验表明RIP3激酶能够分别磷酸化GNAI3和RGS19。因此,我们猜测RIP3激酶可能通过磷酸化GNAI3和RGS19而影响了葡萄糖饥饿诱导的HT29细胞自噬。应用免疫共沉淀结合质谱分析筛选出一些可能的磷酸化位点,GNAI3可能被RIP3激酶磷酸化的位点有:S6和S164;RGS19可能被RIP3激酶磷酸化的位点有:T12、S199、S213和S214。此外,为了寻找葡萄糖饥饿诱导的HT29细胞自噬中,RIP3可能的上下游蛋白,除了GNAI3和RGS19,应用免疫共沉淀结合质谱分析还筛选出了 ACAA1和DDX24两个蛋白。有研究报道ACAA1和DDX24与肿瘤的发生有密切关系,但是其是否参与细胞自噬,目前没有相关报道。这有待于我们后续的进一步深入研究。为了考查RIP3调控的细胞自噬在人结肠癌发生发展和治疗中的影响,我们应用细胞生长曲线、细胞集落形成实验、MTT法检测耐药性和裸鼠皮下移植瘤实验检测RIP3调控的细胞自噬对人结肠癌细胞的影响。研究结果显示敲低RIP3后,HT29细胞生长增快,集落形成能力增强,诱导细胞自噬后的细胞增殖抑制率降低,裸鼠皮下移植瘤体积增大;而过表达RIP3后,HT29细胞生长减慢,集落形成能力减弱,裸鼠皮下移植瘤体积减小。敲低RIP3后,加入无糖培养液诱导,HT29细胞的增殖抑制率降低,说明RIP3的低表达可以通过降低细胞自噬水平而提高其存活率;而加入化疗药物5-FU后,HT29细胞的增殖抑制率升高,说明RIP3的低表达可能通过降低了细胞的自噬水平从而增加了 HT29对化疗药物5-FU的敏感性,因此,认为HT29细胞对化疗药物5-FU的耐药性可以通过降低细胞自噬水平而得到减轻。体内外实验结果一致,表明RIP3能够通过促进细胞自噬而抑制结肠癌细胞HT29的生长,提示RIP3调控的细胞自噬参与了结肠癌的发生发展,其研究结果可为进一步了解结肠癌的发生发展机制和结肠癌的临床治疗提供潜在的应用价值。
【学位单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.35
【部分图文】：

图１细胞自噬信号通路图逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋Ａｕｔｏｐｈａｇｙ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ邋ｐａｔｈｗａｙ逡逑越来越多的研究表明，细胞自噬与肿瘤发生、进展及对抗肿瘤治疗的反应中逡逑有着直接或间接的联系。细胞自噬与肿瘤的关系非常复杂，且仍部分存在争议，逡逑目前认为在肿瘤发生时细胞自噬起到抑制作用，但在肿瘤发展的进程中，细胞自逡逑噬又可能为肿瘤细胞提供对抗营养缺乏和缺氧的机制，促进肿瘤细胞的存活［２８］。逡逑细胞自噬在肿瘤发生发展的过程中发挥着“双刃剑”的作用，不能简单将其划分逡逑为“有害”或“有益”的，研究表明自噬对于肿瘤的影响是分阶段和有针对性的。逡逑细胞自噬缺陷，生物体某些自发性肿瘤的发生几率增高。当肿瘤发生后，自噬作逡逑用又可能为生活环境恶劣的肿瘤细胞提供有效的供养途径。此外，细胞自噬在肿逡逑瘤细胞的抗癌药物介导的细胞死亡中发挥不同作用，在不同肿瘤细胞和不同情况逡逑下细胞自噬可能会促进细胞死亡，也可能保护细胞使细胞对化疗药物产生耐药作逡逑

用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔｔｉｎｇ方法检测ＲＩＰ３的表达水平。结果显示，与对照组相比，逡逑ＲＩＰ３邋ｓｈＲＮＡ组的ＲＩＰ３表达量明显降低，而Ｆｌａｇ－ＲＩＰ３组的ＲＩＰ３表达量明显升逡逑高（图３．１Ａ），差异有统计学意义（ＰＣ０．０１或Ｐ＜０．００１），成功构建出ＲＩＰ３稳逡逑定低表达和高表达的ＨＴ２９突变细胞株。采用无糖培养液诱导细胞自噬，１８小逡逑时后收集细胞提取总蛋白，用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔｔｉｎｇ方法检测细胞自嗤流情况。结果逡逑显示，与对照组相比，敲低ＲＩＰ３后，细胞自噬流降低；而过表达ＲＩＰ３后，细逡逑胞自噬流升高；并且在没有诱导细胞自噬的情况下，ＲＩＰ３低表达细胞的基础白逡逑噬水平降低，ＲＩＰ３过表达细胞的基础自噬水平升高（图３．１Ｂ），差异有统计学逡逑意义（Ｐ＜０．０１）。因此，我们初步明确ＲＩＰ３参与了葡萄糖饥饿诱导的ＨＴ２９细逡逑胞自噬，并且能够促进细胞自噬。逡逑逦ＨＴ２９逦邋ＨＴ２９－ｓｈＣｏｎｔｒｏｌ邋ＨＴ２９－ｓｈＲｎ）３邋ＨＴ２９－Ｆｌａｇ－ＲＩＰ３逡逑Ｖｅｃｔｏｒ邋＋逦＇逦＇逦＊逦Ｃｏｍｐｌｅｔｅ邋Ｍｅｄｉｕｍ邋＋＋－－邋＋邋＋邋－邋？邋＋邋＋邋．－逡逑Ｆｌａｇ－ＲＩＰ３逦＋逡逑Ｃ0？

养液诱导ＨＴ２９－Ｆｌａｇ－ＲＩＰ３细胞自嗤，采用免疫共沉淀的方法检测ＲＩＰ３是否与内逡逑源性的ＧＮＡＩ３和ＲＧＳ１９相互作用。结果显示，随着细胞自噬的增强，ＲＩＰ３与逡逑ＧＮＡＩ３的作用增强，与ＲＧＳ１９也有相互作用（图３．３Ｂ），与前期质谱结果相符。逡逑Ｆｌａｇ－ＲＧＳ１９逦Ｈ逦１逦逡逑Ｍｙｃ－ＧＮＡＩ３邋—Ｉ—Ｉ逦１－－１逦邋ＨＴ２９－Ｆｌａ￡－ＲＩＰ３逡逑Ｆｌａｇ－ＲＩＰ３邋逦１逦ｈＨ逦＾逦Ｎｏ邋ｇｌｕｃｏｓｅ邋Ｍｅｄｉｕｍ邋0邋６逦１９逦２４邋ｈ逡逑Ｍｙｃ－ＲＧＳ１９邋逦１－邋＋逡逑－逦ｌＲ邋ｒ／１逦Ｆｌａｇ－ＲＩＰ３邋ｍｍ邋—？邋ｗｍ邋ａ＊逡逑栜邋ＩＢ：邋Ｍｙｃ逡逑ＩＰ：邋Ｆｌａｇ逦ＩＰ：Ｆｌａｇ邋ＧＮＡＩ３逦Ｗ邋Ｗ逡逑＊＊逦ｍｍ逦—？逡逑ＩＢ：邋Ｆｌａｇ逦ＲＧＳ１９逡逑？邋？逡逑一＾邋逦邋Ｆｌａｇ－ＲＩＰ３逦１逡逑—ＩＢ：邋ＭｙＣ逦ＧＮＡＩ３逦ｉ逦——逡逑Ｉｎｐｕｔ逦—逦—■逦■逦，ｎｐＵｔ逦ＬＣ３－ＩＩ逦逦逡逑ＩＢ：邋Ｆｌａｇ逡逑？邋＾逦ｐ＿Ａｃｔｉｎ逡逑Ａ逦Ｂ逡逑图３．３免疫共沉淀方法检测ＲＩＰ３是否与外源性（Ａ）或内源性（Ｂ）邋ＧＮＡＩ３和逡逑ＲＧＳ１９相互作用逡逑Ｆｉｇ．３．３邋Ｗｈｅｔｈｅｒ邋ＲＩＰ３邋ｉｎｔｅｒａｃｔｓ邋ｗｉｔｈ邋ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ邋（Ａ）邋ｏｒ邋ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ邋（Ｂ）邋ＧＮＡＩ３邋ａｎｄ逡逑ＲＧＳ１９邋ｂｙ邋Ｃｏ－ＩＰ逡逑３．邋２．邋３邋ＧＮＡ１３或ＲＧＳ１９的表达下调会抑制葡萄糖饥饿诱导的ＨＴ２９细胞自噬逡逑鉴于ＲＩＰ３能够与ＧＮＡＩ３和ＲＧＳ１９蛋白相互作用

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 万德森;;结直肠癌流行病学与预防[J];中国中西医结合外科杂志;2011年01期

本文编号：2825502