紫杉醇诱导胃癌细胞衰老相关分泌表型促进胃癌细胞增殖的作用及机制研究

发布时间：2020-09-24 11:47

　　 研究背景和目的:在我国胃癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一,在新增的胃癌患者中90%以上为进展期。对于此类患者,外科手术常难以获得根治性效果,因此,临床开展胃癌新辅助化疗,对于提高手术根治率、提高可切除率以及延长患者生存时间具有重要意义。然而,患者对化疗药物存在个体差异,甚至有部分患者化疗形成耐药后,肿瘤会形成报复性生长。是什么导致肿瘤呈现报复性生长?众多研究表明,衰老是凋亡、自噬之外细胞对于化疗介导DNA损伤反应的一种重要应答形式。通过新辅助化疗的人体内标本研究发现,胃癌新辅助化疗后很大一部分细胞发生衰老。因此,对化疗介导的DNA损伤诱导衰老这重要临床现象进行深入研究,对于提高临床化疗效果具有重要意义。化疗介导衰老细胞的产生,将对化疗本身产生两方面重要影响。首先,该群细胞本身处于不可逆的G0期,因此对放、化疗的反应性极低而难以被彻底清除,成为耐药与复发的重要来源;其次,该群细胞还维持活跃的生理学特性,其重要要特征是持续不断分泌大量生物生物活性物质,如IL-6、IL-8、IL-1α/β、MMPs以及相关生长因子等,即衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)。科室前期使用以紫杉醇类药物为基础的联合方案对胃癌患者进行新辅助化疗,化疗无效组胃癌组织IL-6表达水平显著高于有效组,说明由化疗介导的胃癌组织SASP相关因子IL-6与化疗不敏感密切相关。提示:SASP在胃癌新辅助化疗耐药过程中发挥了重要作用。那么SASP和肿瘤的报复性生长是否存在一定的联系?如果SASP和肿瘤报复性生长存在联系,那么它是通过什么机制产生的呢?近年来,有研究表明固醇调节元件结合蛋白(SREBPs)在多种肿瘤中过表达,提示肿瘤细胞的快速增殖和脂类的快速合成具有密切相关性,抑制SREBPs表达可以显著抑制肿瘤细胞生长。SREBPs转录因子家族成员包括SREBP1和SREBP2。前者在非饱和脂肪酸和甘油三酯合成中起主要调节作用,而后者在调节胆固醇内环境稳态中起关键作用,它是调节脂类平衡的主要转录因子。SREBPs调控多种脂类合成相关基因的表达,如在人胶质母细胞瘤中SREBP1上调并促进及其下游靶基因ACC和FASN的表达;此外,在去年2月,Ayano Kondo等在Cell Reports上发表论文指出,细胞外H~+通过激活SREBP2上调胆固醇合成相关酶基因如:IDI1、MSMO1、INSIG1的表达,促进胰腺癌进展。因此,我们推测SASP可能通过激活SREBP2来促进胃癌细胞增殖,从而促进肿瘤进展。研究内容:在科室前期研究基础上,我们提出如下科学假设:新辅助化疗药物紫杉醇能够诱导胃癌细胞发生衰老,衰老胃癌细胞通过分泌SASP激活SREBP2促进未衰老的肿瘤细胞增殖。(化疗细胞衰老SASPSREBP2细胞增殖)具体研究分两部分进行:一、现象验证,即SASP促进胃癌细胞增殖;二、机制研究即SASP通过激活SREBP2促进细胞增殖。一、现象验证体外实验方法利用紫杉醇(paclixel,PTX)处理BGC823细胞构建衰老细胞模型,使用β-半乳糖苷酶染色证实衰老细胞模型的建立;ELISA检测SASP-CM中主要的SASP因子的浓度;CCK8比色法及细胞克隆形成实验检测SASP-CM对BGC823细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡。所获得BGC823细胞培养上清,即胃癌衰老细胞相关分泌表型条件培养基(senescence-associated secretory phenotype conditioned medium group,SASP-CM),以不加PTX处理的BGC823细胞培养上清为肿瘤细胞条件培养基组(control condition medium group,CTR-CM组)和正常培养基组(normal medium group,NOR-CM组)为对照,共计3组实验。体内实验方法裸鼠皮下成瘤实验分2组,即实验组:5周龄雄性裸鼠5只,每只裸鼠腋下接种200μL等比例胃癌衰老细胞和正常肿瘤细胞混合悬液(5?10~7/mL)。对照组:5周龄雄性裸鼠5只,每只裸鼠腋下接种200μL正常肿瘤细胞悬液(5?10~7/mL),观察成瘤大小。结果PTX 35 nmol/L诱导BGC823细胞72 h可建立稳定的细胞衰老模型,此条件下衰老细胞比例最高(66.95±3.54)%。SASP-CM中主要SASP因子IL-6、IL-8、CXCL1、CCL2、INF-γ浓度均高于CTR-CM。SASP-CM组细胞的相对克隆形成率高于CTR-CM组(P0.001)和NOR-CM组(P0.05)。48、72、96 h时SASP-CM组细胞的增殖活性高于CTR-CM组和NOR-CM组(P0.05)。SASP-CM组的S期细胞比例高于CTR-CM组和NOR-CM组(P0.01),细胞凋亡率各组间差异无统计学意义。裸鼠皮下成瘤实验实验组瘤体重量、体积显著高于对照组(P0.01)。二、机制研究1、我们用SASP-CM和CTR-CM培养BC823细胞72h后,提取总RNA做基因表达谱分析,并根据差异表达基因做GO分析。2、SREBP2是胆固醇合成通路中关键转录因子,因此,我们通过qRT-PCR验证SREBP2及其靶基因表达,免疫荧光及WB证实SREBP2激活。3、我们用siRNA干扰SREBP2表达,并利用qRT-PCR、验证干扰效果,然后用SASP-CM培养SREBP2干扰和未干扰的BC823细胞,cck8检测细胞增殖活性。结果:1、通过基因表达谱分析我们发现:衰老细胞条件培养基能够促进BGC-823细胞胆固醇合成通路中相关酶表达;2、胆固醇合成通路中关键转录因子SREBP2及其靶基因IDI1,MSMO1,INSIG1 mRNA表达水平显著上调;衰老细胞条件培养基导致SREBP2激活并发生核转移;3、siRNA干扰SREBP2表达能够降低衰老细胞条件培养基促进BGC-823细胞增殖的能力。结论:新辅助化疗药物紫杉醇能诱导胃癌细胞发生衰老,衰老的胃癌细胞通过衰老相关分泌表型激活SREBP2促进未衰老的胃癌细胞增殖。
【学位单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.2
【部分图文】：

图1 PTX诱导BGC823细胞产生衰老。A：不同浓度PTX培养BGC823细胞72h后，β-半乳糖苷酶染色；B：不同浓度PTX培养BGC823细胞后72h后，衰老细胞比例。 **P＜0.01被认为有明显差异。(二) EILSA检测各培养基中SASP主要因子浓度SASP因子种类繁多，包括多种炎症因子、趋化因子、生长因子等，它们在肿瘤的发生、发展、转移以及肿瘤的免疫应答中起重要作用。我们对收集的条件培养基做ELISA分析发现，与CTR-CM相比，SASP-CM中IL-6、IL-8、CXCL1、CCL2、INF-γ的浓度均升高（P<0.01），而IL-1β浓度两组间差异无统计学意义，见图2。(三) 各组BGC823细胞的增殖及细胞克隆形成能力我们对各组细胞做CCK8增殖活性检测发现，SASP-CM组细胞的增殖活性随着时间延长而呈现上升趋势，至48、72、96 h时均高于CTR-CM组和NOR-CM组（P<0.05，图1A）。此外，细胞克隆形成实验结果显示，SASP-CM组细胞的克隆形成率高于

图2 ELISA检测SASP细胞因子。与CTR-CM相比，SASP-CM中IL-6、IL-8、CXCL1CCL2、INF-γ的浓度均升高（P<0.01），而IL-1β浓度两组间差异无统计学意义（n=5）。**P＜0.01被认为有明显差异。图3 SASP-CM促进BGC823细胞增殖及细胞克隆形成。（A）SASP-CM培养BGC82

图2 ELISA检测SASP细胞因子。与CTR-CM相比，SASP-CM中IL-6、IL-8、CXCL1CCL2、INF-γ的浓度均升高（P<0.01），而IL-1β浓度两组间差异无统计学意义（n=5）**P＜0.01被认为有明显差异。

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本文编号：2825682