MiR-150在乳头状甲状腺癌中的表达及作用机制研究

发布时间：2020-09-25 20:08

　　 研究背景甲状腺癌(Thyroid Carcinoma,TC)是内分泌系统疾病中最为常见的恶性肿瘤,它主要起源于甲状腺内不同来源的细胞,并被分为四种病理类型,分别为乳头状癌、滤泡状癌、未分化癌和髓样癌。目前针对甲状腺癌已经建立了良好的分型系统,并且不同分型在分子水平、细胞水平和临床特征中观察到较大的特异性。绝大部分甲状腺癌预后良好,但是一些细胞分化程度较差的甲状腺癌分型,其特征在于具有较高的侵袭性,而且尚无有效的治疗方法。虽然甲状腺癌的发病机制尚未完全了解,但一般认为是先天基因和后天环境交互作用的关系,已经发现许多参与其发病的遗传因素。非编码微小RNA(microRNA,miRNA)近年来作为新型的一种小分子标志物质,得到了广泛的关注。miRNA能够调节肿瘤进展的许多方面,其中可以包括细胞增殖能力、迁移能力、侵袭能力、血管生成和抗凋亡的能力。miRNA形成的过程大致为:通过RNA聚合酶II在细胞核中发生,以形成大于lOOOkb的初始miRNA转录本(pri-miRNA),随后由RNA酶III酶Drosha及其辅因子Dgcr-8组成的复合物切割产生65个核苷酸长的前体pre-miRNA,通过EXP5和细胞质RNAse III内切核酸酶,促进Dicer通过腺苷脱氨酶(ADAR)催化肌苷的形成,最后形成成熟的miRNA。miRNA作为一种单链的高度保守的非编码小分子RNA,与包括肿瘤在内的人类许多疾病密切相关。miRNA最初认为是一种负性调节因子,在基因表达过程中扮演重要的角色,以序列互补的形式结合其靶蛋白编码的信使RNA(mRNA)的3'UTR内的区域来发挥它们的作用。然而,最近的研究数据表明,miRNA调控存在比最初所认识的理论更复杂的转录后控制系统。目前miRNA如何通过与基因启动子、编码区以及mRNA3'UTR中的互补区相互作用并激活或抑制基因表达已有较多的研究。miRNA在体内的异常表达与肿瘤的发生、发展有较为紧密的关联。具有原癌基因活性的miRNA(称之为,oncomiR)或具有抑癌基因活性miRNA(称之为,tumor suppressor miRNA)都是与癌症相关的 microRNA(miRNA)。正常机体内环境中,oncomiR与tumor suppressor miRNA的表达水平是一种动态均衡的状况;然而一旦这种平衡失调,机体内细胞将会向恶性转化,促进肿瘤的发生。众所周知,miRNA能够特异性靶向某些信使RNA(mRNA)的3' UTR以防止它们编码特定蛋白质或者直接降解其mRNA。某些miRNA(oncomiRs)的失调与特定的癌症形成、发展紧密相关。有研究报道,机体内异常表达miRNA与甲状腺癌的发生、发展也存在紧密的联系。miRNA与甲状腺癌的发生、发展有着密切的关联,因此miRNA在甲状腺癌临床诊断和治疗中的作用进入了研究人员的视线。越来越多的证据显示,miRNA参与人类恶性肿瘤的发生发展;并且最近有研究报道miRNA在甲状腺肿瘤中可以作为新型的生物标志物,表明这些小的非编码RNA可用于开发诊断试剂盒或者作为临床诊断的新型标志物发挥其重要作用。miR-150是哺乳动物(包括人)中发现的一类miRNA前体家族成员。通过酶Dicer从前体发夹中切下约22个核苷酸的成熟miRNA序列,然后该序列与影响 RNA 干扰的 RNA 诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)相关联。有研究表明,miR-150已经与许多癌症相关联。然而miR150在甲状腺癌中的作用及其机制尚不明确。本研究将对miR-150在乳头状甲状腺癌中的抑癌功能及其调控的靶基因进行研究,为乳头状甲状腺癌的发生发展提供新的理论依据,这可能为乳头状甲状腺癌的分子诊断提供更多的策略及治疗思路。研究目的肿瘤的发生是一种多级反应和突变的过程,miRNA的异常表达在肿瘤的发生发展中有着非常紧密的关系,发挥着重要的作用。其中miR-150对黑色素瘤、肺癌以及肝细胞癌等肿瘤的作用已有相关报道,但对甲状腺癌细胞的作用研究尚少。本研究的目的是为确定miR-150对乳头状甲状腺癌细胞的作用,并进一步探讨miR-150在乳头状甲状腺癌中的作用机制,将来可能会为乳头状甲状腺癌的早期诊断、中期治疗及临床预后提供一种新型的分子标志物。本研究将从以下这几方面进行研究:①检测miR-150在乳头状甲状腺癌组织以及配对的正常癌旁组织中的表达水平。并构建及验证表达miR-150质粒和封闭miR-150的寡核糖核苷酸有效性;②在细胞水平,过表达或封闭miR-150是否具有抑制或促进乳头状甲状腺癌细胞生物功能的作用,研究miR-150对乳头状甲状腺癌细胞增殖、克隆形成能力、细胞周期及细胞凋亡等生物学方面的影响;③预测miR-150的靶基因,并运用EGFP荧光报告系统、RT-qPCR和Western印迹等实验技术方法验证靶基因;④靶基因对乳头状甲状腺癌细胞增殖能力、克隆形成能力、细胞周期进程及细胞凋亡等生物特性方面的影响。实验方法1.在乳头状甲状腺癌组织及其癌旁的正常甲状腺组织中,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)实验检测miR-150的表达水平的变化。2.采用MTT、克隆形成实验,研究miR-150的水平变化对乳头状甲状腺癌相关细胞生长增殖能力的影响。3.采用流式细胞术(Flow CytoMetry)细胞周期实验和细胞凋亡实验检测miR-150的变化对乳头状甲状腺癌细胞周期进程以及细胞凋亡的影响。4.生物信息学技术筛选miR-150的潜在靶基因,并用EGFP荧光报告系统、Western blot和RT-qPCR实验验证直接的靶定关系。5.Western blot和免疫荧光验证miR-150和RAB11A介导的WNT/β-catenin通路的活化。6.动物实验中,通过RT-qPCR方法在TPC-1移植瘤中检测miR-150和RAB11A的表达水平,通过Western blot测定TPC-1移植肿瘤中RAB11A蛋白水平。实验结果1.采用实时荧光定量PCR实验检测10例乳头状甲状腺癌组织及其正常对照组中miR-150的表达水平的变化:miR-150在乳头状甲状腺癌组织中的表达水平相较于癌旁正常组织的表达水平来讲,明显降低。2.MTT实验方法测K1细和TPC-1细胞的活性,在K1细胞和TCP-1细胞中转染 pri-miR-150、pcDNA3、ASO-miR-150、ASO-NC 后,OD570 随着时间的变化,每组的变化情况不同,其中转染pri-miR-150的K1细胞和TCP-1细胞活力变化较其余组明显减弱。克隆形成实验结果显示,转染ASO-miR-150的KI和TCP-1细胞,克隆形成明显增多;而转染pri-miR-150的细胞,克隆形成能力明显降低。流式细胞检测显示表达过多的miR-150组诱导抑制K1细胞和TPC-1细胞的G1期向S期转换,而封闭miR-150后,促进K1细胞和TPC-1细胞的G1期向S期转换;过表达miR-150促进K1细胞和TPC-1细胞凋亡,相对凋亡指数升高,而封闭miR-150后,抑制了 K1细胞和TPC-1细胞的凋亡,相对凋亡指数降低。3.使用TargetScan、miRBase和miRanda三个靶基因预测数据库预测miR-150的靶基因,最终选择miR-150的候选靶基因为RAB11A,利用RT-qPCR进行检测过表达或者抑制miR-150表达后RAB11AmRNA变化的情况,内源性对照为U6,过量表达miR-150的K1细胞和TPC-1细胞中RAB11AmRNA水平分别降低了 45%和57%;而封闭miR-150的K1和TPC-1细胞中RAB11AmRNA水平分别升高了 3.8倍和4.7倍。RAB11A的过度表达促进细胞的恶性表型。4.EGFP的报告载体实验结果显示,同对照组对比,过量表达miR-150的细胞中,RAB11A3'UTR的EGFP荧光表达强度降低,分别降低约50%和52%。而抑制miR-150的细胞中,RAB11A 3'UTR的EGFP荧光表达强度增多,分别提高约43%和45%。但是对于碱基突变的3'UTR组别,无论过表达或者敲降miR-150对突变的RAB11A3'UTR的EGFP荧光表达强度无明显变化。5.运用RT-qPCR的方法检测了 10例乳头状甲状腺癌组织及癌旁健康组织中RAB11A的表达情况,实验将β-actin作为内源性的对照,与正常的对照组相比,乳头状甲状腺癌组织中RAB11AmRNA的水平明显增高,升高了约8.3倍。K1和 TPC-1 细胞分别经转染 pcDNA3/RABI1A、pcDNA3、pSi1encer/shR-RAB11A、pSilencer后,观察集落形成的情况,与对照组相比,过量表达RAB11A后,细胞的集落形成数量分别增多了 1.5倍和1.8倍;而敲降RAB11A后,K1细胞和TPC-1细胞的集落形成数量分别减少了 70%和50%。FACS检测RAB11A对细胞周期的影响:过表达RAB11A,加快了 K1细胞和TPC-1细胞G1到S期的转换,而敲降RAB11A抑制了 K1细胞和TPC-1细胞的细胞周期G1到S期的转换;过表达的RAB11A抑制K1细胞和TPC-1细胞凋亡,相对凋亡指数降低,而敲降RAB11A后,促进了 K1细胞和TPC-1细胞的凋亡,相对凋亡指数升高。miR-150可以抑制乳头状甲状腺癌细胞中RAB11A介导的WNT/β-catenin 激活。6.裸鼠实验中:使用RT-qPCR的方法进行检测两组裸鼠中miR-150和RAB11A。与对照组对比,miR150过表达组中,miR-150的表达水平显著增高,而RAB11A的表达水平则显著降低;通过蛋白印迹法检测了 TPC-1-移植肿瘤中的RAB11A蛋白水平,结果表明,在miR-150转染组中,RAB11A蛋白的表达水平较低。结论1.乳头状甲状腺癌组织中miR-150处于低表达水平。2.过量表达mmiR-150后,会使K1及TPC-1细胞增殖能力减弱、细胞周期G1期向S期进程抑制,促进了细胞的凋亡。相反地,封闭miR-150后,会引起细胞增殖能力增强、细胞周期G1期S期进程加快、抑制了细胞凋亡。3.RAB11A是miR-150的直接靶基因。miR-150在转录后水平抑制RAB11A的表达,miR-150可能通过靶基因RAB11A来发挥其抑癌基因的作用。4.RAB11A能够促进乳头状甲状腺癌细胞的增殖能力,加快细胞周期进程的转化,抑制细胞凋亡。miR-150通过调控RAB11A抑制了 WNT信号通路。5.miR-150能够在体内抑制裸鼠移植瘤的生长,miR-150的过表达可降低RAB11A在移植瘤中的水平。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R736.1
【部分图文】：

采用ＲＴ－ｑＰＣＲ方法检测１０例乳头状甲状腺癌组织及其正常对照组中逡逑ｍｉＲ－１５０的表达水平的变化。本实验以Ｕ６ｓｎＲＮＡ为内源性对照。实验结果如逡逑图１－１所示，乳头状甲状腺癌组织中，ｍｉＲ－１５０的表达水平相较癌旁正常组织，逡逑表达水平明显降低，差异具有明显的统计学意义。逡逑１．５－．逡逑0逡逑Ｔ逦＇逦１逡逑＾邋１．０－逦？逦%

本文编号：2827004