乳酸杆菌通过促进E-钙黏蛋白表达抑制宫颈癌转移的机制研究

发布时间：2020-09-30 14:07

　　目的:宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤,是导致女性死亡的第二大癌症。但是,目前主要采用放、化疗治疗中、晚期宫颈癌,无法降低患者的死亡率,且其无法避免的毒副作用大大降低了患者的生活质量。目前公认人乳头瘤病毒(HPV)的持续感染是宫颈癌发生的主要原因。但是由于抗原本身的复杂性、病毒亚型较多等诸多问题,疫苗的研究也比较困难。因此,我们一直致力于寻找新的治疗手段以延长患者生命,提高其生活质量。乳酸杆菌为女性阴道的正常优势菌群,对维持阴道正常生态平衡起着关键作用,多项研究表明,宫颈癌的发生还与阴道微生态平衡失调有关,其中,乳酸杆菌减少,导致阴道加德纳菌或混合性厌氧菌大量繁殖,产生有害的物质,后者与其他的致癌因素(如人乳头瘤病毒)联合作用于宫颈,加速了宫颈癌的发生。目前研究表明上皮/间质转化(EMT)不仅是多细胞生物胚胎发育与器官形成的基础过程,而且对肿瘤发生、侵袭和转移及多种慢性疾病的发生发展也发挥着重要作用。上皮钙黏蛋白(E-cadherin)能促进细胞间的连接,维持其支架的稳定,是EMT中最重要的中心因子之一,其表达下调往往是宫颈癌转移的重要因素。本实验旨在探索采用乳酸杆菌干预,是否影响宫颈癌细胞的生长、转移,以及相应的作用机制,以为宫颈癌的治疗提供新的视角。方法:1体外实验1.1培养乳酸杆菌(德氏乳杆菌DM8909)。1.2乳酸杆菌直接作用与人宫颈癌Hela细胞以及鼠宫颈癌细胞U14,(MOI:选取10:1,100:1,1000:1,分别作用24h,48h,72h,CCK-8细胞增殖试剂盒检测乳酸杆菌对宫颈癌细胞增殖的影响。1.3划痕实验检测乳酸杆菌对宫颈癌细胞迁移的影响。1.4乳酸杆菌分别直接刺激Hela和U14,及通过transwell小室间接刺激宫颈癌细胞,与不同时间点收集细胞,提取蛋白,行Western blot检测可能影响细胞生长、迁移的相应因子E-钙黏蛋白、波形蛋白(vimentin)、FOXO4、Snail、Twist及β-catenin的表达情况。1.5 65 oC 30min灭活乳酸杆菌后作用于宫颈癌细胞,与不同时间点分别收集细胞行Western blot,检测上述可能涉及到的因子的表达情况。2体内实验取4～6周龄的雌性BALB/C小鼠25只,随机分为5组(荷瘤对照组,治疗剂量组(2.25×106个/0.2ml)及相应灭活菌组、高剂量组(5×106/0.2ml)及相应灭活剂量组),每组5只。取对数生长期U14细胞2×106个/0.2ml接种于每组小鼠背部皮下。接种第二天后开始抑瘤实验。治疗剂量组及相应灭活剂量组组分别在肿瘤周围多点注射活或灭活的乳酸杆菌2.25×106/0.2ml(治疗剂量),高剂量组及相应灭活剂量组小鼠以同样方式分别注射活或灭活的乳酸杆菌5×106/0.2ml(高剂量),每天一次,连续20天;荷瘤小鼠注射等量的PBS作为对照。每天检测小鼠体重及肿瘤大小。停药一天后,处死取瘤。称体重并用游标卡尺测量肿瘤长径(L)和短径(W),并按肿瘤体积计算公式V=L·W2/2计算肿瘤体积。然后,切开肿瘤,观察其内部颜色、质地、有无坏死区。将瘤组织分为两部分,一部分10%多聚甲醛固定液固定后,切片行免疫组化,一部分提蛋白行Western Blot,检测上述各因子表达。结果:1.乳酸杆菌对宫颈癌细胞的增殖无影响。2.乳酸杆菌作用于宫颈癌细胞后,24小时既表现出对宫颈癌细胞的迁移抑制作用。3.乳酸杆菌作用宫颈癌细胞后,上调了E-钙黏蛋白的表达。在人宫颈癌Hela中,下调Snail的表达,但对小鼠宫颈癌细胞U14中的Snail表达无影响。但对vimentin、FOXO4、Twist及β-catenin的表达无影响。4.乳酸杆菌通过transwell间接刺激宫颈癌细胞Hela和U14后,可促进E-钙黏蛋白的表达明显增加。5.灭活乳酸杆菌作用于宫颈癌细胞后,E-钙黏蛋白的表达与对照组无明显差异。6.荷瘤小鼠体重在乳酸杆菌干预3天后开始具有统计学差异,治疗剂量组体重均小于其他四组体重,并均具有统计学差异;高剂量组及相应灭活剂量组的体重均小于荷瘤对照组和灭活治疗剂量组的体重,并具有统计学差异;但荷瘤对照组和灭活治疗剂量组之间,以及高剂量组及相应灭活剂量组之间无统计学差异。7.治疗剂量组及高剂量组肿瘤净体积均小于其他三组体积及重量,并均具有统计学差异,但是治疗剂量组和高剂量组之间,以及荷瘤实验组、灭活剂量组和灭活高剂量组之间无统计学差异。8.治疗剂量组及高剂量组的肿瘤中的E-钙黏蛋白的表达明显高于其他三组,但是治疗剂量组和高剂量组组间以及荷瘤实验组、灭活剂量组和灭活高剂量组之间无统计学差异。但是5组之间波形蛋白、FOXO4、Snail、Twist及β-catenin的表达无统计学差异。9.免疫组化HE染色证实荷瘤小鼠模型为鳞癌。治疗剂量组及高剂量组中E-钙黏蛋白所占的比例要大于相应灭活剂量组及对照PBS组并具有统计学差异。结论:1.乳酸杆菌对宫颈癌的增殖无明显影响。2.乳酸杆菌对宫颈癌的迁移有抑制作用。2这种迁移作用是通过上调E-钙黏蛋白表达实现。3在人宫颈癌中,可能是通过下调Snail而促进了E-cadherin的表达。4乳酸杆菌上调E-钙黏蛋白的表达并不受Twist、β-catenin影响。5乳酸杆菌上调E-钙黏蛋白的表达是通过其分泌到胞外的成分实现。
【学位单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：R737.33
【部分图文】：

乳酸杆菌,宫颈癌细胞

图 1 CCK-8 检测乳酸杆菌对宫颈癌细胞增殖的影响。Fig.1 The proliferation of cervical cancer cells following stimulation wilactobacillus by CCK8 kit.Hela Ctrl0h

乳酸杆菌,宫颈癌细胞,划痕实验

附图1 CCK-8 检测乳酸杆菌对宫颈癌细胞增殖的影proliferation of cervical cancer cells following stimlactobacillus by CCK8 kit.BHela Ctrl

乳酸杆菌,宫颈癌细胞,灭活,蛋白印迹

21图 4 蛋白印迹检测乳酸杆菌及灭活乳酸杆菌刺激宫颈癌细胞后 E-cadh表达的影响。A 乳酸杆菌通过 transwell 小室间接刺激宫颈癌细胞后E-cadherin 表达的影响。B 灭活乳酸杆菌刺激宫颈癌细胞后 E-cadherin达的影响。C Hela 细胞 E-cadherin 灰度值分析。D U14 细胞 E-cadheri度值分析。Fig.4 Western blot analysis of E-cadherin expressions in cervical cancer cposted-coincubated with live or inactivated lactobacillus. A.The expressioE-cadherin in cervical cancer cells indirectly stimulated with lactobacilluthrough transwell. B The expression of E-cadherin in cervical cancer celindirectly stimulated with inactivated lactobacillus. C. Gray value analysisE-cadherin in Hela cells. D. Gray value analysis of E-cadherin in U14 cel

【参考文献】