聚多巴胺纳米颗粒负载肿瘤抗原用于治疗结直肠癌的研究

发布时间：2020-10-11 08:42

　　 随着手术和化疗的发展,结直肠癌(CRC)的治疗策略不断进步,但在疗效和不良副反应方面仍面临严峻的挑战。最近免疫治疗得到大家的广泛认可,对某些类型的癌症也包括结直肠癌的治疗取得了突破性的进展。同时,优于传统疫苗的新型疫苗正在研发。以重组抗原或多肽为基础设计的多肽疫苗由于具有良好的特异性和安全性,有望成为传统疫苗的替代品。从另一方面来说,聚合物纳米颗粒具有强大的负载抗原能力,较好的生物相容性,灵活的可修饰性等特点使其作为抗原载体在肿瘤免疫治疗中具有突出的优势。因此作为新型疫苗的纳米颗粒疫苗正在受到越来越多的关注。然而,有效地激活体内抗肿瘤免疫以达到治疗肿瘤的目的仍然是开发疫苗的一个重大的挑战。本文采用生物相容性良好、负载量高的聚多巴胺纳米颗粒(PDANPs)负载肿瘤模式抗原OVA或肿瘤细胞裂解物,并对其进行了体内外免疫学评估及抗肿瘤效果测试,评价PDANPs负载单一抗原及复合抗原后对结肠癌荷瘤鼠抗肿瘤免疫效果,为PDANPs应用到肿瘤免疫领域提供基础实验数据和参考。论文主要分为以下三个部分:第一部分描述了携带肿瘤模式抗原OVA和绿色荧光蛋白(GFP)的OVA-GMC38结肠癌细胞系的构建。首先设计并构建了携带肿瘤模式抗原OVA和GFP报告基因的双基因慢病毒载体。采用嘌呤霉素在该慢病毒感染的MC38细胞中筛选阳性OVA-GMC38细胞。通过激光共聚焦显微镜、流式细胞术、蛋白质印迹(Western Blot)和定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测出GFP和OVA基因在MC38细胞中稳定表达。在C57BL/6小鼠皮下种植OVA-GMC38,考察其对荷瘤小鼠动物模型建立的影响,实验结果表明与MC38相比,基因转染对OVA-GMC38结肠癌细胞系致瘤能力没有影响。利用OVA免疫荷瘤小鼠,初步结果显示OVA-GMC38可用于评价结肠癌中针对OVA抗原的免疫治疗效果。第二部分研究了负载模式抗原OVA的聚多巴胺纳米颗粒(OVA@PDANPs)的表征和治疗功效。制备OVA@PDANPs作为肿瘤疫苗,通过粒径分析仪及扫描电子显微镜观察纳米颗粒成均匀的、单分散的球形,细胞毒性实验表明纳米颗粒具有良好的生物相容性。共聚焦显微镜观察纳米颗粒吞噬发现纳米颗粒能够增加细胞对抗原的吞噬,并且被细胞内化的纳米颗粒可实现部分溶酶体逃逸。活体成像研究结果说明OVA@PDANPs能够促进抗原在淋巴结处的聚集,并延长抗原滞留时间。而后的流式细胞术分析结果说明OVA@PDANPs能够促进淋巴结内DCs表面成熟标志物的表达。建立OVA-GMC38结肠癌荷瘤小鼠模型,对荷瘤小鼠的免疫实验表明OVA@PDANPs能够明显抑制肿瘤的生长,提高脾脏、淋巴结、肿瘤组织中CD4+、CD8+T细胞的比例,促进了 T细胞反应和T细胞增殖,改善肿瘤中免疫抑制的微环境。研究结果表明OVA@PDANPs具有良好的免疫刺激作用,具有应用为肿瘤疫苗的潜力。第三部分聚焦于负载肿瘤裂解物的聚多巴胺纳米颗粒(TCL@PDANPs)的研究。通过多巴胺自聚合制备PDANPs,再通过Michael加成和Schiff碱反应将肿瘤裂解物(TCL)共价连接到PDANPs的表面上。TCL@PDANPs的平均尺寸为241.9nm,多分散指数为0.200,具有良好的储存稳定性,对APC具有低的细胞毒性。此外,TCL@PDA NPs促进抗原摄取和DC成熟,导致DC细胞表面与抗原提呈相关的标志物的表达和细胞因子的分泌增强。用TCL@PDANPs免疫荷瘤小鼠后,肿瘤进展显著延迟,细胞毒性CD8+T细胞和记忆T细胞亚群显著增加,从而提供长期的抗肿瘤保护。此外,肿瘤内显著增多的CTL和明显锐减的M1型TAM以及骨髓来源的免疫抑制细胞提示TCL@PDA NPs具有突出的抗肿瘤能力。总体而言,由于抗原加载方法简单、制备快速、有效的激活免疫和突出的抗肿瘤能力,作为抗原递送载体,PDANPs是极具潜力的候选者。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.34;R318.08
【部分图文】：

为了验证ＯＶＡ基因表达情况，提取ＯＶＡ－ＧＭＣ３８细胞总ＲＮＡ和膜蛋白，分??别通过ｑＲＴ－ＰＣＲ和ＷＢ从ｍＲＮＡ和蛋白质水平检测ＯＶＡ基因的表达。０ＶＡ－ＧＭＣ３８??细胞中ＯＶＡ表达水平高于未感染的ＭＣ３８细胞约６９倍（图２．４）。ＷＢ方法检测结??果显示（图２．５），作为阳性对照的Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ细胞有明显的ＯＶＡ表达（以膜蛋白??内参Ｎａ－Ｋ－ＡＴＰａｓｅ标准化后的光密度比值为０．７１），ＯＶＡ－ＧＭＣ３８细胞中也有ＯＶＡ??表达（以膜蛋白内参Ｎａ－Ｋ－ＡＴＰａｓｅ标准化后的光密度比值为１．１１），而ＭＣ３８和空??病毒转染的细胞（ＫＢ－ＭＣ３８）中无ＯＶＡ表达。上述实验结果提示经过筛选，获得??了?ＯＶＡ－ＧＭＣ３８细胞的稳定株。??１００－１???Ｉ?氺氺氺?Ｉ??屮?８０＿?１?＇??＾６０－?＿??？?４０－??Ｂ??２０－??０－＊?１?＊???ＭＣ３８?ＯＶＡ－ＧＭＣ３８??图２．４?ＭＣ３８细胞、ＯＶＡ－ＧＭＣ３８细胞ＯＶＡｍＲＮＡ表达水平??Ｆｉｇｕｒｅ?２．４?Ｈｉｓｔｏｇｒａｍ?ｏｆ?ＯＶＡ?ｍＲＮＡ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｌｅｖｅｌ?ｉｎ?ＭＣ３８?ｃｅｌｌｓ?ａｎｄ?ＯＶＡ－ＧＭＣ３８??ｃｅｌｌｓ（ｎ＝３）．?＊?尸?＜０．０５

为了验证ＯＶＡ基因表达情况，提取ＯＶＡ－ＧＭＣ３８细胞总ＲＮＡ和膜蛋白，分??别通过ｑＲＴ－ＰＣＲ和ＷＢ从ｍＲＮＡ和蛋白质水平检测ＯＶＡ基因的表达。０ＶＡ－ＧＭＣ３８??细胞中ＯＶＡ表达水平高于未感染的ＭＣ３８细胞约６９倍（图２．４）。ＷＢ方法检测结??果显示（图２．５），作为阳性对照的Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ细胞有明显的ＯＶＡ表达（以膜蛋白??内参Ｎａ－Ｋ－ＡＴＰａｓｅ标准化后的光密度比值为０．７１），ＯＶＡ－ＧＭＣ３８细胞中也有ＯＶＡ??表达（以膜蛋白内参Ｎａ－Ｋ－ＡＴＰａｓｅ标准化后的光密度比值为１．１１），而ＭＣ３８和空??病毒转染的细胞（ＫＢ－ＭＣ３８）中无ＯＶＡ表达。上述实验结果提示经过筛选，获得??了?ＯＶＡ－ＧＭＣ３８细胞的稳定株。??１００－１???Ｉ?氺氺氺?Ｉ??屮?８０＿?１?＇??＾６０－?＿??？?４０－??Ｂ??２０－??０－＊?１?＊???ＭＣ３８?ＯＶＡ－ＧＭＣ３８??图２．４?ＭＣ３８细胞、ＯＶＡ－ＧＭＣ３８细胞ＯＶＡｍＲＮＡ表达水平??Ｆｉｇｕｒｅ?２．４?Ｈｉｓｔｏｇｒａｍ?ｏｆ?ＯＶＡ?ｍＲＮＡ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｌｅｖｅｌ?ｉｎ?ＭＣ３８?ｃｅｌｌｓ?ａｎｄ?ＯＶＡ－ＧＭＣ３８??ｃｅｌｌｓ（ｎ＝３）．?＊?尸?＜０．０５

与ＭＣ３８相比，ＯＶＡ－ＧＭＣ３８细胞致瘤能力没有受基因转染的影响，可以用于小鼠??结肠癌肿瘤模型的相关实验，且致瘤率与未转基因前一样，都是１００％；肿瘤生长速??度二者也无统计学差异（图２．６）。??Ａ?Ｂ??８００－１?ＭＣ３８?２２１?ＭＣ３８??§?ＯＶＡ－ＧＭＣ３８?ｎｃ?ｎｓｊｆ?＾?＋?ＯＶＡ－ＧＭＣ３８??Ｊ＾ＯＯ－?＾２０－?Ａ??ｌ?４００＇??｜２：Ｚ?１６?，??４?６?８?１０?１２?１４?１６?１８?２０?２２?０?２?４?６?８?１０?１２?１４?１６?１８?２０?２２??时间（天）?时间（天）??图２．６荷瘤小鼠的平均肿瘤体积和体重变化。??Ｆｉｇｕｒｅ?２．６?Ｔｈｅ?ｃｈａｎｇｅ?ｏｆ?ａｖｅｒａｇｅ?ｔｕｍｏｒ?ｖｏｌｕｍｅ?ａｎｄ?ｗｅｉｇｈｔ?ｏｆ?ｔｕｍｏｒ－ｂｅａｒｉｎｇ?ｍｉｃｅ．?Ｔｈｅ??ｄａｔａ?ｉｓ?ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ?ａｓ?ｍｅａｎ?土?ＳＤ?（ｎ＝６）．?＊?Ｐ?＜?０．０５，?＊＊?尸?＜?０．０１，＊＊＊?Ｐ?＜?０．００１．??２．４．４?ＯＶＡ－ＧＭＣ３８荷瘠小鼠的抗肿瘤免疫测试??为了进一步验证ＯＶＡ－ＧＭＣ３８用于肿瘤免疫的可行性，第０天，将ＯＶＡ－ＧＭＣ３８??注射于小鼠的右侧腹部皮下建立小鼠结肠癌模型，用ＯＶＡ免疫，第２１天剥离小鼠??肿瘤组织，如图２．７?Ａ？Ｄ显示ＯＶＡ免疫组肿瘤明显小于ＰＢＳ组，实验结果提示ＯＶＡ??免疫能明显延缓ＯＶＡ－ＧＭＣ３８肿瘤的生长。与ＰＢＳ对照组相比，ＯＶＡ免疫后肿瘤??组织质量显著降低０＝３．５９０
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本文编号：2836355