细胞增殖在Notch1高表达急性T淋巴细胞白血病中的作用研究

发布时间：2020-10-11 11:00

　　 研究背景:急性T淋巴细胞白血病(Acute T cell leukemia,T-ALL)是一组起源于T系淋巴祖细胞的血液系统恶性肿瘤,多见于儿童及40岁以上成人。T-ALL患者通常白细胞高,易浸润神经系统,并伴有纵隔肿块。据统计约70%病人伴有Notch1基因的突变,突变Notch1基因参与T-ALL肿瘤细胞增殖、分化、代谢等多种细胞活动。在我们的前期研究中,成功建立了Notch1转基因斑马鱼,并且通过转录组测序,筛选出差异表达基因,发现细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4、CDK6等基因高表达。因此本文旨在研究CDK4/6是否在Notch1高表达的T-ALL发病中起到一定作用?CDK4/6选择性抑制剂Palbociclib,能否逆转部分白血病细胞增殖。研究目的:应用Notch1转基因斑马鱼与T-ALL细胞株,探讨Notch1高表达T-ALL发病中细胞增殖相关的体内、外机制研究,并应用细胞周期抑制剂进行靶向药物干预效价探索。研究方法:体内实验,分别选用Notch1转基因斑马鱼系以及野生斑马鱼系作为实验组和对照组,对两组进行转录组测序分析,遴选Notch1可能的靶基因;选用差异基因的抑制剂进行活体干预,RT-qPCR方法定量检测基因表达。体外实验,分别选取高表达Notch1的T-ALL细胞株(A3、MOLT-4)与正常人外周血单个核细胞为实验组和对照组,PCR方法用于检测两组细胞中Notch1信号相关基因的表达;CCK8法检测Palbociclib对上述细胞的增殖抑制率;细胞涂片观察细胞的增殖及形态;并利用流式细胞术分析两组细胞在Palbociclib不同浓度时的细胞周期;及RT-qPCR检测相关基因表达。研究结果:在Notch1转基因斑马鱼中转录组测序结果提示CDK4/6高表达,RT-qPCR检测不同浓度Palbociclib(0、50、100nM)处理后的斑马鱼标本,上述基因表达被抑制。常规PCR检测在T-ALL细胞株同样高表达CDK4/6、Myc、Notch1等基因。细胞周期分析,Palbociclib处理前,A3、MLOT-4的(S+G2)期分别为(55.93±1.18)%及(58.17±2.40)%,高于对照组(48.93±1.85)%);药物处理后,两组细胞均呈浓度依赖的(S+G2)期下降(P0.05);细胞血检查发现,100nM浓度时,T-ALL细胞株的(S+G2)期细胞接近对照组(P0.05)。RT-qPCR结果提示,相比0nM浓度,CDK4/6在50、100nM浓度时表达下降,并与浓度呈正相关,而Myc、Notch1基因在50nM时无差异,Myc基因在100nM时表达下调,而Notch1基因在100nM时表达上调(P0.05)。研究结论:在Notch1转基因斑马鱼和Notch1高表达的T-ALL细胞株高表达CDK4/6、Myc等基因,Palbociclib不仅可以通过抑制CDK4/6使肿瘤细胞阻滞在G1期,使增殖受抑,并且可以抑制T-ALL下游基因Myc的表达而抑制肿瘤细胞增殖,可以对抗部分Notch1对肿瘤细胞的促进增殖作用。
【学位单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R733.71
【部分图文】：

图 2-1. 阴性对照斑与 Notch1马鱼；Figure2-1. Heatmap of theNotch12.5.2 RT-qPCR 定量检测 Notch1为了验证转录组测序的RT-qPCR 结果显示（图 2-2Notch1、Myc 等 Notch1 信号通路相关基因CDK6 等基因（P < 0.05）。转基因斑马鱼差异基因群聚类图。F: fli1 对照组斑N: Notch1 转基因斑马鱼。difference genes between negative control grouptransgenic zebrafish.转基因斑马鱼相关基因表达Notch1 转基因斑马鱼与 Tg 斑马鱼存在的差异基因，2），相比对照组斑马鱼系，Notch1 转基因斑马鱼信号通路相关基因（P < 0.05），以及细胞周期相关基因and转基因斑马鱼高表达细胞周期相关基因 CDK

2-2. Notch1 转基因斑马鱼相关基因转录水平照组，NOTCH1: Notch1，Notch1 转基因斑马鱼基因igure2-2．Transcri周期选择性抑制剂otch1 转基因斑马鱼胚胎经不同浓度（iclib 处理 72h 后，应用表明，Palbociclib 将 80μM (1/2 LC50)A。Tg: (fli1:EGFP)斑马鱼转基因斑马鱼；RT-qPCR 结果提示，相比对转基因斑马鱼高表达 Notch1、Myc、CDK4、CDK6。（两组组间比较采用配对 t 检验，* P<0.0；**P < 0.01）Transcriptional levels of the genes in Notch1 transgeneic fPalbociclib 药物作用斑马鱼胚胎经不同浓度（50、100、 200、 400后，应用显微镜观测并记录其生存状况，斑马鱼的半数致死浓度 LC50 是 162.8 ±8.16μM（见Palbociclib 作为后续实验的最大浓度。、斑马鱼实验的最大浓度。

Palbociclib 在斑马鱼的半数致死量 LC50 A. Palbociclib 处理 72h 时的生存状况，并记录得出的统计数字。（蓝色代表生存死）。B.利用 graphad 将 A 的数据处理后计算得到 LC50 的图示，Notch1 转基因斑马鱼的 LC50=（162.8±8.16）μM。-3. Maximum non-lethal concentration and LC50 determinatPalbociclib.lib 处理后的基因表达水平改变结果显示（图 2-4）， Palbociclib 应用可以显著下调 的关键基因（CDK4、CDK6）,并随 Palbociclib 浓度 2-4A）。而对于 Notch1 信号通路的基因，相比 0μM,其otch1、Myc 的转录水平均没有明显改变（P > 0.05）；8下降（P < 0.05），然而 Notch1 相比对照浓度反而轻微上
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本文编号：2836497