免疫检查点TIM-3单抗的制备及其功能测定
发布时间：2020-10-14 03:15
癌症是威胁人类健康的重大疾病之一。为了治愈癌症,各国研究人员尝试了多种抗肿瘤策略。近十年来,随着对人类免疫系统研究的逐步深入,免疫检查点疗法逐渐步入人们的视野。尤其是2014年后,随着PD-1单抗的正式上市,利用免疫检查点蛋白阻断信号通路,并以此用来上调或者下调T细胞的活性。但随着对PD-1单抗的耐药性与自体免疫系统并发症的产生,同为T细胞表面负调节分子的TIM-3逐渐被重视,越来越多的研究开始重视TIM-3在各种疾病中的作用,并将其作为一种新的免疫检查点分子。本文首先介绍了TIM-3分子的结构特征、及其三个重要配体,其次描述了TIM-3与其配体间的相互作用,通过配体如Galectin-9等结合TIM-3导致Th1细胞的功能耗歇和最终凋亡,这种结合同时也调控Th1和Th17细胞的细胞因子的分泌情况。因此构建了可表达TIM-3序列的重组质粒,其后,通过电转导的方法用DNA直接免疫BALB/c小鼠,达到免疫周期后,取其脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,进一步将TIM-3阳性反应的克隆号再进行三次ELISA筛选,获得多株分泌TIM-3单抗的杂交瘤细胞克隆号,最后将杂交瘤细胞注射到BALB/c小鼠腹腔中制备腹水并进一步纯化得到单抗。其次用Western blot、ELISA、EC_(50)、immunofluorescence、flow cytometry等方法鉴定抗体特异性识别与亲和性的能力。并将纯化后获得的TIM-3单抗与PBMC、DC、DC-CIK、CD4~+T等T细胞共同孵育后,特异性地与T细胞表面的TIM-3分子结合,阻断了TIM-3/Galectin-9通路,通过对其共培养后上清液中分泌的IL-2、IFN-γ等细胞因子含量的检测,发现TIM-3单抗与PBMC细胞混合孵育后,能够有效杀伤U937、MDA-MB-231等肿瘤细胞系。最后在MDA-MB-231细胞系建模的雌性BALB/c裸鼠中,PD-1与TIM-3单抗联用治疗组相较于PD-1和TIM-3单抗组、Control组更能有效抑制肿瘤细胞的生长速率与远处转移情况,提高荷瘤小鼠的生活质量,并且延长小鼠的生存时间。通过DNA免疫获得的TIM-3单抗可以特异性的识别并与TIM-3分子结合,阻断Galectin-9配体与TIM-3分子的通路,逆转T细胞的耗竭现象,促进T细胞的增殖并激活其分泌细胞因子的能力。TIM-3单抗能有效封闭T细胞表面活化的TIM-3分子,在体内和体外实验中有效杀伤肿瘤细胞。掌握TIM-3受体分子与各类配体间信号通过介导关系后,将有利于TIM-3抗体的研发和功能检测,为未来利用TIM-3单抗有针对性地治疗各种与免疫系统相关的疾病,为肿瘤免疫治疗开辟一条新的途径。
【学位单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R730.51
【部分图文】：
学硕士论文 免疫检查点 TIM-3 单抗的制备及其3 的分子结构胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域家族（T cell immunoglobulin aontaining molecules family，TIM），最初是由 Mcintire 等[4]在中发现的。其后，在人染色体 5q33.2 上也发现了 TIM 家族[5TIM-3 和 TIM-4 等多个受体分子。研究发现，只有在活化的达 TIM-3 受体分子。其分子结构较为简单，基本由 22-124aa5-201aa 的黏蛋白结构域、跨膜区和 224-301aa 的细胞质尾部如下图 1.1 所示：
路严重失调的情况下，将会引发各类自身系统性慢性疾病，对患者的生存质量有较大的影响。在肿瘤免疫微环境中，HMGB1与肿瘤浸润的DC上的TIM-3相互作用，通过阻断 Toll样受体3（TLR3）、TLR7、TLR9及细胞质中DNA和RNA相关的正常转运来抑制免疫反应，导致肿瘤的免疫逃逸，减弱DNA预防治疗及化疗的效果。CEACAM1与TIM-3结合能抑制T细胞的作用并且是慢性病毒感染或者肿瘤微环境中T细胞功能耗竭的一种标记[10]。大量的证据表明，TIM-3参与包括肿瘤在内的多种疾病的发生和发展，并对疾病的免疫调节起关键作用。1.3 TIM-3/Galectin-9 通路在肿瘤中的调节机制根据Ana C. Anderson[11]等的最新研究，阐述了TIM-3在肿瘤中的作用。如图1.2所示：
浙江理工大学硕士论文 免疫检查点 TIM-3 单抗的制备及其功能测定（5）吸取400 μl 生理盐水将细胞转移至流式管中，用流式细胞仪检测并处理实验结果[19]；2.4 结果与分析2.4.1 TIM-3 单抗在蛋白层面的特异性识别将 TIM-3 蛋白与 TIM-1、TIM-4 蛋白同时在 A、B 两块胶上上样跑胶，在A 胶上所有上样孔均孵育经 A 蛋白亲和层析法获得的 TIM-3 单抗，在 B 胶上 a孔孵育制备获得的 TIM-3 单抗，b 孔、c 孔均孵育购自 BD 公司的 TIM-1、TIM-4 单抗。Western blotting 结果显示如下图：
【参考文献】
本文编号：2840096
【学位单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R730.51
【部分图文】：
学硕士论文 免疫检查点 TIM-3 单抗的制备及其3 的分子结构胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域家族（T cell immunoglobulin aontaining molecules family，TIM），最初是由 Mcintire 等[4]在中发现的。其后，在人染色体 5q33.2 上也发现了 TIM 家族[5TIM-3 和 TIM-4 等多个受体分子。研究发现，只有在活化的达 TIM-3 受体分子。其分子结构较为简单，基本由 22-124aa5-201aa 的黏蛋白结构域、跨膜区和 224-301aa 的细胞质尾部如下图 1.1 所示：
路严重失调的情况下，将会引发各类自身系统性慢性疾病，对患者的生存质量有较大的影响。在肿瘤免疫微环境中，HMGB1与肿瘤浸润的DC上的TIM-3相互作用，通过阻断 Toll样受体3（TLR3）、TLR7、TLR9及细胞质中DNA和RNA相关的正常转运来抑制免疫反应，导致肿瘤的免疫逃逸，减弱DNA预防治疗及化疗的效果。CEACAM1与TIM-3结合能抑制T细胞的作用并且是慢性病毒感染或者肿瘤微环境中T细胞功能耗竭的一种标记[10]。大量的证据表明，TIM-3参与包括肿瘤在内的多种疾病的发生和发展，并对疾病的免疫调节起关键作用。1.3 TIM-3/Galectin-9 通路在肿瘤中的调节机制根据Ana C. Anderson[11]等的最新研究，阐述了TIM-3在肿瘤中的作用。如图1.2所示：
浙江理工大学硕士论文 免疫检查点 TIM-3 单抗的制备及其功能测定（5）吸取400 μl 生理盐水将细胞转移至流式管中，用流式细胞仪检测并处理实验结果[19]；2.4 结果与分析2.4.1 TIM-3 单抗在蛋白层面的特异性识别将 TIM-3 蛋白与 TIM-1、TIM-4 蛋白同时在 A、B 两块胶上上样跑胶，在A 胶上所有上样孔均孵育经 A 蛋白亲和层析法获得的 TIM-3 单抗，在 B 胶上 a孔孵育制备获得的 TIM-3 单抗，b 孔、c 孔均孵育购自 BD 公司的 TIM-1、TIM-4 单抗。Western blotting 结果显示如下图：
【参考文献】
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本文编号：2840096
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