SIRT6对非小细胞肺癌生物学功能的影响及机制的初步探讨

发布时间：2020-10-14 03:35

　　 研究背景和目的:肺癌目前已成为世界范围内发病率和死亡率高居首位的恶性肿瘤~([1]),主要分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer SCLC)及其他类型的肺癌,本课题主要针对NSCLC细胞生物学功能展开研究。随着临床技术的不断发展放射治疗成为NSCLC主要治疗手段之一,虽然放射治疗已经取得一定临床疗效但并未明显改善肺癌患者的预后。相关研究表明侵袭转移是导致肺癌患者预后不良的主要原因,同时放射性肺损伤(radiation-induced lung injury RILI)是肺癌放射治疗过程中最主要剂量限制性毒性因素。沉默信息调节因子SIRT6具有NAD+依赖性的蛋白去乙酰化酶、ADP-核糖转移酶等活性,是一种在肿瘤发生发展过程中发挥重要作用的调控蛋白~([2]),最新研究表明SIRT6在肿瘤侵袭转移方面、炎症反应方面及放疗抵抗方面具有重要作用,但SIRT6在肺癌中的机制研究依然有限。因此本课题初步探讨了调控SIRT6表达对NSCLC侵袭转移及炎症反应的影响及其可能的作用机制,同时检测调控SIRT6后NSCLC细胞经射线照射后的存活情况,明确SIRT6在NSCLC放射性肺损伤和放疗抵抗中的作用,为肺癌的治疗从基础到临床转化提供了新的思路和理论依据。研究方法:1.应用Western blot技术检测SIRT6蛋白在肺癌组织和正常肺组织中的表达,构建NSCLC细胞SIRT6过表达及敲除载体。包装慢病毒感染A549、H1299细胞株,筛选出SIRT6过表达的稳定细胞系,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除A549细胞中SIRT6,筛选出SIRT6敲除的稳定细胞系。2.通过细胞划痕愈合试验、transwell侵袭实验探讨调控SIRT6表达后对NSCLC细胞侵袭转移能力的影响;利用实时定量RT-PCR检测在NSCLC细胞中调控SIRT6表达后EMT细胞表面标志物表达的变化;应用Western blot技术筛选出SIRT6影响NSCLC侵袭转移的信号通路。3.利用实时定量RT-PCR检测在NSCLC中调控SIRT6表达后相关炎症因子表达的变化;应用Western blot技术筛选出在顺铂刺激情况下影响炎症反应的信号通路,初步探讨SIRT6影响肺癌细胞炎症反应的可能机制。4.采用CCK-8法检测在A549细胞中调控SIRT6表达后经射线照射细胞生存曲线的变化,初步探讨SIRT6对A549细胞射线照射后细胞存活率的影响,明确SIRT6在肺癌放疗抵抗中的作用。研究结果:1.Western blot技术检测结果显示,SIRT6蛋白在NSCLC癌组织中的表达量明显低于癌旁组织;成功构建NSCLC细胞SIRT6过表达、敲除细胞系,测序比对结果后显示A549细胞、H1299细胞成功过表达SIRT6,A549细胞中成功敲除提前设计的SIRT6靶点;Western blot技术检测过表达细胞系中SIRT6蛋白表达明显上调,敲除成功细胞系中未见SIRT6蛋白表达。2.过表达SIRT6后A549细胞迁移未见明显变化,而在H1299细胞中过表达SIRT6后细胞迁移明显受到抑制,A549细胞敲除SIRT6后形态明显发生变化,由多角形或椭圆形细胞变为细长成纤维样细胞,是上皮间质转换(Epithlial-mesenchymal transition简称EMT)的主要特征,且细胞迁移明显加快;侵袭实验结果显示过表达SIRT6后A549细胞侵袭数目明显减少,敲除SIRT6呈相反结果。A549细胞敲除SIRT6后细胞上皮标志物E-cadherin mRNA表达量明显下调,细胞间质标志物N-cadherin、vimentin mRNA表达量明显上调。对于机制研究,通过Western blot技术筛选信号通路发现加入ERK1/2信号通路激活剂EGF后SIRT6可抑制其磷酸化水平,而smad2/3等信号通路磷酸化水平未见明显变化。以上结果提示我们SIRT6可能通过ERK1/2信号通路抑制NSCLC细胞的侵袭转移。3.在SIRT6过表达和敲除细胞系中分别加入顺铂诱导其炎症反应的发生,实时定量RT-PCR检测相关炎症因子mRNA表达量情况,过表达SIRT6后A549细胞中IL-1A、IL-1B、IL-12mRNA表达量下调,而敲除SIRT6后呈现相反的结果。过表达SIRT6后A549细胞中加入顺铂,30min后检测p-NF-κB蛋白表达下调。据此我们推测在肺癌细胞中SIRT6可能通过NF-κB信号通路抑制炎症反应。4.对NSCLC细胞采用Simens ARTISTE直线加速器产生的6MV-X射线进行体外细胞照射,源皮距SSD为100cm,射野10×10 cm,剂量率是600MU/min。按照0Gy、5Gy、10Gy、15Gy、20Gy的射线剂量梯度进行细胞照射,照射后48小时应用CCK-8试剂检测细胞存活情况,结果显示随着照射剂量的增加过表达SIRT6后A549细胞存活率未见明显变化,而敲除SIRT6后A549细胞存活率明显增加。研究结论:SIRT6蛋白在NSCLC组织中的表达低于癌旁组织;SIRT6可能通过ERK1/2信号通路有效抑制NSCLC细胞的侵袭迁移;SIRT6可能通过NF-κB信号通路抑制A549细胞炎症反应的发生;SIRT6可降低NSCLC细胞放疗后细胞存活率,有助于解决肺癌放疗抵抗问题。
【学位单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R734.2
【部分图文】：

（8）1×TBST：称取 50ml1M Tris-HCl（PH8.0），45g NaCl，5ml Tween-2加水溶解后定容至 5L。2.实验方法及实验步骤首先收集临床样本，应用 Western blot 技术检测 SIRT6 蛋白在 NSC癌中和癌旁组织中表达的差异，了解 SIRT6 在 NSCLC 组织中的表达情构建 SIRT6 过表达、敲除质粒，筛选出二者稳定细胞株，通过基因测序术确定构建质粒的正确性；构建成功的质粒分别采用包装慢病毒、瞬间染的方式，传送到肺癌细胞中调控 SIRT6 表达。因成功构建的质粒具有呤霉素抗性（如图 1-1），可通过加入嘌呤霉素筛选已转染正确质粒的细胞将筛选出的稳定细胞系利用 Western blot 技术检测 SIRT6 蛋白表达情况体实验步骤如下。

SIRT6 对非小细胞肺癌生物学功能的影响及机制的初步探讨 2015 级硕士学位毕业3.实验结果3.1 SIRT6 在肺癌中的表达情况：本部分通过Western blot技术检测SIRT6蛋白在肺癌和癌旁组织中的达情况，共检测 14 例癌及癌旁组织，其中腺癌和鳞癌各 7 对。结果显不管是腺癌组织还是鳞癌组织，癌旁组织的 SIRT6 蛋白表达量明显高于组织中（图 1-2）。

图 1-2 SIRT6 在非小细胞肺癌中的表达(T:肿瘤，N:癌旁)Figure 1-2 The expression of SIRT6 in NSCLC (T: Tumor, N: normal Tissue)细胞过表达 SIRT6 基因的稳定细胞株筛选 SIRT6 基因结果验证6 基因 PCR 产物经 1.2%琼脂凝胶电泳鉴定，可见大小带，即为目的基因 SIRT6 条带，如图 1-2。
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本文编号：2840118