RIP-1促进胆囊癌增殖侵袭转移的作用及机制

发布时间：2020-10-17 02:59

　　 研究背景及目的:业已证明TNF-α具有促进胆囊癌细胞增殖和侵袭转移的作用。然而作为TNF-α-TNFR1信号通路的关键蛋白RIP1(receptor-interacting protein-1,受体相互作用蛋白-1),其对于肿瘤的发生发展的作用及其具体的分子机制鲜见报道。本研究拟围绕以下问题开展实验:RIP1在胆囊癌中的表达及与临床参数之间的关系;进一步进行体外细胞实验,探讨RIP1对胆囊癌细胞增殖、凋亡、侵袭及对VEGF-C表达的影响及其机制。方法:收集60例胆囊癌和17例癌旁正常组织石蜡标本,通过免疫组织化学法检测RIP1的蛋白表达;结合临床资料分析RIP1表达与临床参数间的关系。通过RT-PCR和Western-blot技术检测3个胆囊癌细胞株中RIP1的表达情况。通过RNAi技术特异性的沉默胆囊癌细胞中RIP1;RT-PCR、Western-blot验证;通过细胞增殖实验(MTT)、Transwell小室侵袭实验、流式细胞仪检测凋亡实验检测RIP1基因沉默对胆囊癌细胞生物学行为的影响。通过Western-blot分析RIP1基因沉默对AKT、p-AKT、NF-κB(p65)、p-NF-κB(p-p65)、c-jun(AP-1)、p-c-jun(p-AP-1)、VEGF-C蛋白表达的影响。构建VEGF-C启动子截短缺失体片段及各个突变体双荧光素酶报告载体,用双荧光素酶报告基因检测系统检测各启动子片段活性,确定VEGF-C启动子关键活性区域,通过生物信息学分析预测关键活性区域存在关键转录因子结合位点、通过重叠PCR方法定点诱变技术突变特定转录因子位点对VEGF-C启动子活性的影响、进一步细胞外实验凝胶电泳迁移率阻滞实验(EMSA)和活体细胞实验染色质免疫共沉淀实验(Ch IP)确定RIP1通过NF-κB和AP-1调控VEGF-C基因启动子的活性。结果:1 RIP1在胆囊癌组织中的表达(MOD值=0.3134±0.0802)显著高于胆囊正常组织(MOD值=0.1345±0.1220),P0.0001;RIP1的表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小、组织学分级无关;而RIP1的表达与胆囊癌患者的临床分期(I~III vs.IV~V;P=0.0021)、淋巴结转移(无转移组vs.有转移组;P=0.047)和有无结石(有结石vs.无结石;P=0.0382)相关。2 RIP1的m RNA和蛋白在三株胆囊癌细胞系均有表达,NOZ细胞RIP1蛋白表达最强。构建的沉默质粒P-1/si RNA—P-4/si RNA中P-1/si RNA最大程度沉默了NOZ细胞的RIP1表达,差异有统计学意义P0.05。P-1/si RNA组细胞增殖比NC/si RNA组和control组(即未转染组)细胞缓慢(P0.05),而NC/si RNA组和control组细胞增殖无差异(P0.05)。P-1/si RNA组细胞穿到下室的细胞数比NC/si RNA组和control组细胞数目少,差异有统计学意义P0.05;而NC/si RNA组和control组穿到下室的细胞数目无差异(P0.05)。P-1/si RNA、NC/si RNA和control组胆囊癌细胞的凋亡情况无差异。P-1/si RNA组细胞中AKT、p-AKT、NF-κB(p65)、p-NF-κB(p-p65)、c-jun(AP-1)、pc-jun(p-AP-1)蛋白表达量比NC/si RNA组和control组表达量少,差异有统计学意义P0.05;而NC/si RNA组和control组表达无差异(P0.05)。P-1/si RNA组VEGF-C m RNA和蛋白的表达量比NC/si RNA组和control组表达量减少,结果有显著差异P0.05;而NC/si RNA组和control组VEGF-C m RNA和蛋白表达无差异(P0.05)。3-332bp到-190bp是VEGF-C启动子保持转录表达活性的关键区域。VEGF-C启动子片段PGL3B-332的荧光活性随着RIP1的表达升高而升高,呈剂量效应增加;发现VEGF-C启动子-332bp至-190bp区域存在两个交错重叠的AP-1位点(-207 to-192bp GGCGCGTCAGTCATG;两个AP-1位点分别为:GGCGCGTCAGT和CGTCAGTCATG),调控VEGF-C启动子活性。4证实RIP1可激活NF-κB和AP-1转录因子结合在VEGF-C启动子-332bp至-190bp区域,增强VEGF-C启动子活性;结论:1 RIP1在胆囊癌组织中的表达显著增加;RIP1的表达与胆囊癌患者的临床分期、有无结石以及淋巴结转移明显相关。2 RIP1促进胆囊癌细胞的增殖和侵袭,对凋亡无影响;RIP1促进胆囊癌细胞RIP1-NF-κB/AP-1-VEGF-C信号通路分子的表达。3-332bp到-190bp是VEGF-C启动子保持转录表达活性的关键区域。在VEGFC启动子-332bp到-190bp区域存在两个AP-1结合位点,是调控VEGF-C启动子活性的重要位点。4 RIP1通过NF-κB和AP-1转录因子与VEGF-C基因启动子结合位点结合调控VEGF-C启动子的活性,从而影响VEGF-C的表达。
【学位单位】：福建医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R735.8
【文章目录】：
英文缩略词表
中文摘要
英文摘要
前言
第一部分RIP1在胆囊癌组织中的表达及其临床意义
    引言
    材料与方法
    结果
    讨论
    小结
第二部分RIP1沉默对胆囊癌细胞增殖、凋亡、侵袭的影响及机制
    引言
    材料与方法
    结果
    讨论
    小结
第三部分RIP1调控胆囊癌细胞分泌VEGF-C的分子机制
    引言
    材料与方法
    结果
    讨论
    小结
结论
参考文献
综述:RIP1:细胞存活与肿瘤
    参考文献
攻读学位期间完成的学术论文
致谢

【参考文献】

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1 张利霞;沈云志;邱全兴;汪良芝;秦怡;;胆汁中IL-6、TNF-α、IL-8检测对急性胆管炎诊断和严重程度的判断价值[J];国际消化病杂志;2008年04期

本文编号：2844168