RIP1对胆囊癌TNF-α诱导VEGF-C表达及微淋巴管生成的影响及机制

发布时间：2020-10-17 05:36

　　 【研究背景及目的】慢性炎症始终伴随着胆囊癌的发生和发展。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一个重要的炎症刺激因子,我们的前期实验已证实它可以通过激活NF-κB介导血管内皮生长因子C(VEGF-C)表达,从而促进胆囊癌微淋巴管生成。受体相互作用蛋白1(RIP1)是TNF-α信号通路中调控细胞存亡的一个重要因子,在胆囊癌组织中呈高表达。然而,RIP1是否参与TNF-α信号通路诱导VEGF-C的表达进而促进胆囊癌微淋巴管的生成仍未知。本项目拟阐明RIP1调控胆囊癌细胞TNF-α-NF-κB-VEGF-C信号通路的机制及在胆囊癌微淋巴管形成中的作用。【方法】1、用不同浓度的TNF-α刺激胆囊癌细胞株NOZ和GBC-SD,通过Western blot检测胆囊癌细胞中RIP1蛋白水平的变化,以确定TNF-α最佳的刺激浓度和时间。2、以慢病毒RIP1-shRNA和siIκBα分别转染两株胆囊癌细胞株NOZ和GBC-SD,构建RIP1和IκBα沉默的细胞株,用PcDNA3.1-RIP1重组质粒转染RIP1沉默的细胞株,构建回复表达的细胞株。3、通过Western blot检测IκBα、p-IκBα、TAK1、NEMO、VEGF-C蛋白的表达情况;用ELISA试验检测上清液VEGF-C蛋白水平;用双荧光素酶报告法定量检测VEGF-C启动子和NF-κB活性;用染色质免疫沉淀试验(ChIP)分析NF-κB与VEGF-C启动子的关系,于此来验证RIP1在TNF-α-NF-κB-VEGF-C信号通路中的作用。4、用三维共培养法(胆囊癌细胞+淋巴内皮细胞)和原位移植裸鼠模型的体内外实验来评估RIP1对TNF-α诱导的胆囊癌微淋巴管形成和淋巴转移的影响。5、用免疫组化方法检测人胆囊癌组织标本中RIP1、TNF-α和淋巴管密度的表达情况,分析了RIP1蛋白与TNF-α蛋白以及淋巴管密度的相关性。【结果】1、TNF-α可以促进NOZ和GBC-SD胆囊癌细胞株RIP1蛋白的表达,并呈浓度和时间的依赖性,50ng/ml的TNF-α是刺激RIP1蛋白表达的最佳浓度。2、在NOZ和GBC-SD胆囊癌细胞株中,RIP1是TNF-α激活NF-κB活性的必需因子。当沉默RIP1的表达后,TNF-α激活NF-κB的能力受到明显影响,而回复表达RIP1后,可以恢复TNF-α激活NF-κB的能力;而当IκBα与RIP1共沉默时,也恢复了TNF-α激活NF-κB的能力。免疫共沉淀显示RIP1与TAK1、NEMO蛋白之间存在着相互作用的关系。表明TNF-α通过RIP1与TAK1、NEMO的相互作用磷酸化IκBα,从而导致IκBα的降解,进而激活NF-κB。3、RIP1通过NF-κB通路调控TNF-α诱导的VEGF-C表达。沉默RIP1或加入NF-κB抑制剂的NOZ和GBC-SD胆囊癌细胞株中:TNF-α诱导的VEGF-C启动子的活性减弱;TNF-α诱导的VEGF-C蛋白的表达也减弱,而回复表达沉默的RIP1后,可以恢复TNF-α诱导的VEGF-C蛋白的表达。此外,ChIP实验也证实了当沉默了RIP1后,TNF-α增强NF-κB和VEGF-C启动子结合的能力减弱。4、在体外实验中,RIP1可以调控TNF-α-VEGF-C轴介导的NOZ和GBC-SD胆囊癌细胞株对淋巴内皮细胞成管能力。在沉默RIP1的NOZ或GBC-SD胆囊癌细胞株和淋巴内皮细胞共培养实验中,TNF-α刺激增加的淋巴成管的数目减少,而当回复表达RIP1后,淋巴成管的数目得到了恢复。而在沉默RIP1的胆囊癌细胞的培养基中加入VEGF-C蛋白也部分恢复了TNF-α诱导的淋巴成管的数目,说明了RIP1可以调控TNF-α介导的胆囊癌细胞对微淋巴管生成的影响,且主要与VEGF-C蛋白水平有关。5、在裸鼠的原位种植瘤模型中,RIP1可以调控TNF-α诱导的胆囊癌淋巴管生成和淋巴转移。沉默RIP1的NOZ胆囊癌细胞株移植模型中:TNF-α刺激所致的裸鼠淋巴结转移率减少;免疫组化检测淋巴管密度(LVD)证实了TNF-α诱导的胆囊癌淋巴管生成减少。6、收集30例胆囊癌组织石蜡标本,通过免疫组织化学法检测TNF-α、RIP1、LVD的表达,分析RIP1与TNF-α、LVD的相关性,结果表明RIP1的表达与TNF-α的表达以及LVD呈正相关。【结论】1、TNF-α增强胆囊癌细胞RIP1蛋白的表达并呈浓度、时间依赖性。2、RIP1是TNF-α激活胆囊癌细胞NF-κB活性的必需因子。3、RIP1通过NF-κB信号通路调控TNF-α诱导的胆囊癌VEGF-C的表达,从而影响了胆囊癌微淋巴管生成和淋巴转移。
【学位单位】：福建医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R739.8
【部分图文】：

25图 1.1 pNFκB-luc 荧光素酶报告质粒的图谱2.7.3 质粒的转化1）将 20μl 连接产物加入 100μl DH5α感受态(CaCl2方法制备)中，冰30min。2）42℃，热休克 2min。3）快速置于冰浴 2min。4）加入 800μl 无抗生素抗性 LB 培养液，37℃，200g 震荡培养 40min。5）4000g、离心 2min 收集细菌。6）弃 800μl 上清，留 100μl 重悬细菌沉淀。7）将沉淀全部涂布于含 100μg/ml 氨苄青霉素的 LB 平板，37℃恒温培

图 1.2 Western bolt 检测不同浓度 TNF-α 刺激胆囊癌细RIP1 蛋白表达情况图 1.3 Western bolt 检测结果半定量分析不同浓度 TNF-α 刺激

Westernbolt检测结果半定量分析不同浓度TNF-α刺激胆囊癌细胞RIP1蛋白表达情况（*p<0.05,**p<0.01）
【参考文献】

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1 蒋雷;陈燕凌;佘菲菲;唐南洪;李秀金;王晓茜;;胆囊癌组织中血管内皮生长因子C和D的表达及其与淋巴管和血管生成的关系[J];中华肿瘤杂志;2010年03期

2 周连锁,石景森,王作仁,王林;肿瘤坏死因子在胆囊癌及结石组织中的表达[J];癌变.畸变.突变;2000年03期

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1 朱广伟;RIP-1促进胆囊癌增殖侵袭转移的作用及机制[D];福建医科大学;2015年

本文编号：2844358