锌指蛋白146对小鼠精原细胞化疗后DNA损伤的保护作用研究

发布时间：2020-10-17 13:35

　　 睾丸是对化疗药物高度敏感的器官,化疗后出现不同程度睾丸功能损伤的患者越来越多,严重影响男性生殖健康。吡柔比星(pirarubicin,THP)是血液系统及泌尿系统恶性肿瘤[1,2]治疗常用的化疗药。针对体内异常增殖的肿瘤细胞,THP能够造成细胞DNA损伤,诱导肿瘤细胞凋亡。然而,体内分裂活跃的细胞,如生殖细胞,对于化疗药物表现出高度敏感性。锌指蛋白146(Ring finger protein,RNF146)是一种新近发现的具有E3泛素连接酶活性的DNA损伤反应蛋白[3]。预实验中我们发现其在成年雄性小鼠睾丸组织中高表达。RNF146在新生小鼠睾丸组织中表达极低,随着性发育表达水平迅速升高。这一现象引起了我们的重视,然而仍有一些问题需要深入探索。RNF146在成年小鼠睾丸精原细胞中高表达的意义是什么?小鼠化疗后精原细胞的DNA损伤与RNF146之间存在联系吗?RNF146能否作为化疗后改善精原细胞DNA损伤的靶点呢?为此,我们进行了下列两部分研究工作:第一部分RNF146在小鼠睾丸组织中的表达及定位特点目的:明确DNA损伤反应蛋白RNF146在小鼠睾丸组织中的表达规律及细胞定位特点。方法:取成年雄性C57小鼠8只,分别提取包括睾丸在内的主要组织器官总蛋白,通过Western-blot实验评价RNF146表达的组织特异性。取新生、7日龄、1月龄、3月龄和1年龄雄性C57小鼠各5只,提取一侧睾丸组织总蛋白,经Western-blot观察C57小鼠睾丸组织中RNF146的表达规律,另一侧睾丸组织制备石蜡切片。通过HE染色、免疫组化和免疫荧光染色明确小鼠睾丸组织中RNF146与生精细胞发育的关系及成年小鼠睾丸曲精小管中RNF146细胞定位特点。结果:Western-blot结果提示在成年雄性C57小鼠全身各脏器中,RNF146主要表达于肺、睾丸、脑和脾等脏器中,肝、肾及胃中表达水平极低;随着小鼠的性发育,睾丸组织中RNF146表达水平迅速升高,老年鼠睾丸组织中RNF146表达降低。免疫组化和免疫荧光染色提示成年雄性小鼠睾丸组织中RNF146主要定位在曲精小管精原细胞上,间质血管及支持细胞几乎不表达。结论:RNF146在正常成年雄性C57小鼠各器官中表达具有组织特异性,肺、睾丸及脑是其主要表达脏器。睾丸中RNF146的表达水平随小鼠性发育迅速升高,老年阶段降低。成年小鼠睾丸组织中RNF146主要定位在曲精小管的精原细胞区域,提示其可能与精原细胞的功能有关。第二部分RNF146对吡柔比星引起的小鼠睾丸精原细胞DNA损伤的保护作用目的本实验以小鼠睾丸精原细胞株GC-1为细胞模型,通过包装RNF146过表达慢病毒及对照病毒,感染GC-1细胞,采用吡柔比星干预的方法复制精原细胞DNA损伤模型。观察基因rnf146是否对化疗药吡柔比星干预所引起的精原细胞株GC-1 DNA损伤具有保护作用。方法以小鼠睾丸组织总RNA为模板反转录合成c DNA,设计引物PCR扩增rnf146片段,将片段与载体p CDH连接以构建p CDH-rnf146重组质粒,以Lipofectamine?3000为介质将重组质粒p CDH-rnf146、载体对照质粒p CDH-egfp以及包装质粒ps PAX2、p MD2.G共转H E K293T细胞包装病毒。以小鼠睾丸精原细胞株GC-1为观察对象,设置Blank、Lenti-EGFP及Lenti-RNF146三组GC-1细胞,采用L enti-RN F146过表达慢病毒感染的方法复制RNF146过表达的GC-1细胞模型,无关病毒Lenti-EGFP感染组为平行对照,通过Western blot鉴定Lenti-RNF146在GC-1细胞中的过表达效率。采用吡柔比星处理的方法复制GC-1细胞的DNA损伤模型,Brd U掺入标记实验评价吡柔比星对GC-1细胞增殖的影响并确定最佳干预浓度,彗星实验评价吡柔比星对GC-1细胞DNA完整性的影响,Tunel染色分析吡柔比星对GC-1细胞凋亡的影响。在吡柔比星干预的GC-1、L enti-EG FP/GC-1和Lenti-RNF146/GC-1三种细胞模型中,通过彗星实验、T UN EL染色分析RNF146对吡柔比星引起的GC-1细胞增殖抑制、凋亡增多及D NA损伤的保护作用。结果成功构建了小鼠p CDH-rnf146重组质粒并包装得到了RNF146过表达慢病毒,Western blot结果提示Lenti-RNF146过表达慢病毒能够显著上调GC-1细胞中RNF146的表达效率。1.0μg/m L为吡柔比星干预GC-1细胞的最佳处理浓度。Brd U掺入标记显示RNF146能够减轻吡柔比星引起的GC-1细胞增殖抑制。TUNEL染色提示RNF146能够缓解吡柔比星诱导的GC-1细胞凋亡。彗星实验显示RNF146过表达能够有效保护吡柔比星作用下GC-1细胞DNA的完整性。结论RNF146对化疗药吡柔比星引起的小鼠睾丸精原细胞损伤具有保护作用。
【学位单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：R730.53
【部分图文】：

与心脏组织相比，*P<0.051-1 免疫印迹分析小鼠各脏器中 RNF146 表达 RNF146 在睾丸组织中表达迅速增加1d）、七日龄（7d）、一月龄（1m）、三月睾丸组织总蛋白，以 GAPDH 为内参，抗丸组织中 RNF146 表达水平。图 1-2 可见表达，随年龄增加，RNF146 表达升高，

Western-blot分析不同年龄雄性小鼠睾丸组织RNF146表达水平

组织形态学变化。镜下可见一日龄小鼠睾丸组织曲精小管内细胞层数少胞类型单一，核染色较深，多为原始生精细胞（精原细胞）和支持细胞（-3 A）。七日龄小鼠睾丸组织曲精小管直径加粗，细胞层数增加，细胞类以精原细胞为主（图 1-3 B）。两周龄小鼠睾丸组织曲精小管直径继续加宽近基底膜处主要为精原细胞，向管中方向出现具有分裂相的精母细胞（-3 C）。三周龄小鼠睾丸组织曲精小管直径继续加宽，细胞层数增多，细型复杂，基底膜向曲细精管内细胞依次为精原细胞、初级精母细胞、次母细胞（图 1-3 D）。一月龄的小鼠已趋于性成熟，部分曲精小管管腔有精子细胞及甚至变形精子出现，曲细精管内有空腔形成（图 1-3 E）。三小鼠睾丸组织不同分期的曲精小管中细胞排列整齐，部分管腔可见梭形和成熟的精子（图 1-3 F）。
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本文编号：2844851