乳源六肽提高卵巢癌细胞对顺铂的敏感性的实验研究

发布时间：2020-10-17 12:29

　　 目的：研究乳源六肽(PGPIPN)与抗癌药物顺铂(DDP)联合使用对人卵巢癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响,探究其可能的分子机制及其信号途径,探索研发治疗卵巢癌的新方法和新手段。方法：1.用组织块培养法培养原代卵巢癌细胞,并且用免疫荧光染色法鉴定原代细胞的纯度：2.MTS实验法检测并计算出DDP对人卵巢癌敏感细胞株SKOV3和耐药细胞株SKOV3/DDP半数致死量(IC50)的数值,并得出SKOV3/DDP相对于SKOV3的耐药指数(RI)；3.MTS实验法检测不同浓度PGPIPN、DDP单独用药及联合用药对人卵巢癌细胞生长的增殖抑制的情况：4.用流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期；5.克隆形成实验检测用药后对细胞成瘤的影响；6.细胞划痕实验检测用药后细胞迁移能力的影响,细胞侵袭实验检测用药后对细胞侵袭和转移的影响,并用HE染色观察PGPIPN、DDP单独用药及两者联合作用下卵巢癌细胞的形态学改变；7.RT-PCR法检测Aktl、PI3K、MDR1和ERCC1基因水平表达改变；8.Western Blot法检测pAKT、PI3K、P-gp和ERCC1蛋白水平表达的改变。结果：1.通过组织块培养法成功培养出原代卵巢癌细胞细胞,经鉴定其纯度可达96.8%；2.MTS结果显示DDP对SKOV3的24h、48h、72h的IC50值分别为10ug/ml、5.56 ug/ml、3.23 ug/ml,DDP对SKOV3/DDP的24h、48h、72h的IC50值分别为24.9 ug/ml、9.9 ug/ml、7.63 ug/m1,计算出SKOV3/DDP相对于SKOV3的24h、48h、72h耐药指数为：2.49、1.78、2.36；3.MTS结果显示与对照组相比,单独DDP、PGPIPN用药组和PGPIPN联合DDP对卵巢癌都有抑制作用,而PGPIPN联合DDP处理组抑制率显著高于单独用药组,组间差异有意义(P0.05,P0.01),且呈剂量和时间依赖性；4.用药48h后,PGPIPN、DDP单独用药和联合用药组都可以诱导卵巢癌细胞凋亡,联合用药组随着PGPIPN剂量的增加,与DDP组相比凋亡率逐渐增加,说明PGPIPN可以促进DDP诱导卵巢癌细胞的凋亡；5.通过细胞流式术检测发现,PGPIPN和DDP都可将细胞阻滞在G2/M期,联合用药时,可发现联合用药后增强了两种药物的作用效果,G2/M期阻滞率较单独用药组都增高；6.克隆形成实验发现,用药组与正常对照组相比,细胞克隆形成抑制率明显增高,联合用药组与单独DDP组相比,克隆抑制率明显升高,且呈剂量依赖性,实验说明PGPIPN可以促进DDP抑制卵巢癌细胞的克隆形成；7.细胞划痕实验发现,用药组的细胞迁移能力明显比对照组降低,联合用药组与DDP单独用药组相比,细胞迁移能力随着PGPIPN浓度的增加而降低(P0.05,P0.01)；8.细胞侵袭实验结果显示,随着联合用药中PGPIPN浓度的增加,穿过小室的细胞数逐渐减少,说明PGPIPN可以促进DDP对细胞侵袭能力的抑制；HE染色后观察细胞形态,可见PGPIPN处理形态变化不明显,细胞数减少。DDP处理的细胞固缩,极性减弱,细胞数变少。PGPIPN+DDP组改变更明显,核染色加深,极性减弱,细胞数变少；9.PCR结果显示,用药后Aktl、PI3K、ERCC1和MDR1基因水平水平显著下降,联合用药和单独DDP组相比,随着PGPIPN浓度的增高,Aktl、PI3K、ERCC1和MDR1基因水平表达水平下降的越明显,差异具有统计学意义(P0.05,P0.01)；10.Western Blot结果显示,用药后pAKT、PI3K、ERCC1和P-gp蛋白表达水平显著下降,联合用药和单独DDP组相比,随着PGPIPN浓度的增高,pAKT、PI3K和P-gp蛋白表达水平下降的越明显,差异具有统计学意义(P0.05,P0.01)结论：1.原代卵巢癌细胞培养成功,其纯度可供下一步实验；2.PGPIPN可以加强DDP对卵巢癌增殖抑制的作用；3.PGPIPN可以促进DDP诱导卵巢癌的凋亡；4. PGPIPN联合DDP对卵巢癌的周期主要影响在G2/M期；5. PGPGIPN可以加强DDP抑制卵巢癌的侵袭和迁移的能力：6.PGPIPN可以增强DDP对细胞克隆形成抑制的能力；7. PGPIPN联合DDP用药后,细胞极性减弱,细胞变圆,细胞数变少；8.PGPIPN联合DDP用药后Akt1、PI3K、ERCC1和VDR1基因水平及蛋白表达量下降,说明PGPIPN提高卵巢癌细胞对DDP的敏感性与PI3K/AKT通路相关,同时也可以降低耐药基因的表达。
【学位单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：R737.31
【文章目录】：
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材料与方法
结果
讨论
结论
参考文献
附录
致谢
综述 肿瘤耐顺铂机制的研究进展
    参考文献

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本文编号：2844778