沉默Matriptase对胰腺癌细胞株SW1990及移植瘤生长的影响

发布时间：2020-10-18 00:32

　　 第一部分沉默Matriptase对胰腺癌细胞株SW1990生长的影响目的:探讨沉默Matriptase对胰腺癌株SW1990体外生长的影响,并探讨其对胰腺癌细胞株SW1990可能的作用机制。方法:根据Genbank中Matriptase的编码区基因序列NM_021978.3及相关参考文献,合成特异性针对Matriptase的si RNA及与Matriptase无关的阴性对照si RNA,瞬时转染胰腺癌细胞株SW1990;实验分为4组:阴性对照组(A组)、12.5 n M(B组)、25 n M(C组)、50 n M Matriptase-si RNA组(D组);利用real time PCR技术测定转染后24h各组细胞中Matriptase在m RNA水平上的相对表达量;Western blot技术检测转染后24 h各组细胞Matriptase在蛋白水平的相对表达量;明胶酶谱检测各组细胞在转染24 h后Matriptase酶活性及MMP-9表达量的变化,CCK-8检测各组细胞在转染24 h后细胞增殖能力的变化;划痕实验检测各组细胞在转染24 h后细胞迁移力的变化;Transwell侵袭实验检测各组细胞在转染24 h后细胞侵袭力的变化。Western blot检测各组细胞在转染24 h后u PA/pro-u PA、HGF、AKT、p-AKT、E-cadherin表达量的变化。结果:(1)胰腺癌细胞株SW1990、As PC-1中都有Matriptase的高表达,SW1990、As PC-1的蛋白表达量分别为(0.94±0.63)、(1.58±0.15);胰腺癌细胞株Pa TU8988中无Matriptase的表达。(2)胰腺癌细胞株SW1990在转染NC、12.5 n M、25 n M、50 n M Matriptase-si RNA 24 h后,各组Matriptase m RNA水平分别为1、0.44±0.05、0.28±0.04、0.25±0.07;但Matriptase蛋白表达水平分别是0.74±0.06、0.49±0.04、0.34±0.01、0.24±0.05。(3)Matriptase-si RNA转染前后细胞增殖力的变化,各组的24 h的吸光度分别为0.62±0.01、0.62±0.03、0.37±0.05、0.33±0.05;48 h的吸光度分别为0.77±0.05、0.69±0.03、0.48±0.02、0.42±0.05(4)A组及C组划痕间距分别为0.061±0.013、0.368±0.014,可见C组细胞的迁移距离明显降低;而A组和C组穿膜细胞数分别是(416±1.3)与(109±2.8),可见转染胰腺癌细胞株SW1990 Matriptase-si RNA后细胞的侵袭力明显降低。(5)Matriptase-si RNA转染前后Matriptase蛋白酶活性及MMP-9的变化,A、B、C、D各处理组的Matriptase酶活性分别1.50±0.16、1.21±0.27、0.64±0.16、0.62±0.03;MMP-9的活性分别为0.93±0.26、0.48±0.36、0.35±0.11、0.35±0.12。其中C组与D组的Matriptase酶活性及MMP-9活性明显降低(6)经转染处理后A、B、C、D组的u PA/pro-u PA的比值分别为3.52±0.04、1.11±0.11、0.15±0.06、0.12±0.08;p-AKT各组的蛋白表达量分别为0.91±0.16、0.37±0.20、0.27±0.17、0.09±0.06;AKT蛋白相对表达量分别为1.13±0.05、1.01±0.11、1.22±0.19、1.03±0.37;E-cadherin蛋白相对表达量分别为1.20±0.09、0.87±0.92、0.85±0.08、0.63±0.26;结果示转染Matriptase-si RNA后u PA/pro-u PA比值降低,p-AKT表达量减少,AKT及E-cadherin表达量无明显变化。结论:沉默Matriptase使细胞的增殖、迁移及侵袭能力明显下降。其机制可能是抑制了Matriptase酶活性,导致pro-u PA的活化降低,进而导致MMP-9的活化、AKT的磷酸化减弱,最后细胞的增殖、迁移及侵袭下降。第二部分沉默Matriptase对胰腺癌细胞株SW1990移植瘤生长的影响目的:探讨沉默Matriptase对胰腺癌株移植瘤体内生长的影响,并探讨其在体内对胰腺癌细胞株移植瘤可能的作用机制。方法:(1)利用磷酸钙沉淀法制备慢病毒,并转导胰腺癌细胞株SW1990用于干扰Matriptase的表达,利用倒置荧光显微镜及流式细胞分析仪检测转染效果,流式细胞分选仪进行细胞分选,收集稳转细胞株;Western blot技术检测干扰效果。(2)建立胰腺癌皮下移植瘤模型:将4周的BALB/c雌性裸鼠分为两组,分别为空载体组(sh NC组)、转染组(sh MT1),并监测小鼠的体重、肿瘤大小,待肿瘤体积长至500 mm3后,动物成像仪拍照。颈椎脱臼法处死小鼠,皮下剥离肿瘤,去除包膜,记录肿瘤的重量及体积。(3)将取下的肿瘤组织Western blot及免疫组化检测各组肿瘤组中Matriptase、MMP-9、E-cadherin量的变化。结果:(1)sh NC组在第7、14、21、28、35天的肿瘤体积分别为(2.236±0.024)mm3、(52.60±0.082)mm3、(130.4±0.023)mm3、(308.1±0.283)mm3、(568.2±0.048)mm3,sh MT1组在第7、14、21、28、35天的肿瘤体积分别为(2.197±0.035)mm3、(21.46±0.022)mm3、(78.61±0.012)mm3、(102.7±0.120)mm3、(150.8±0.036)mm3;sh NC组的肿瘤重量为0.96±0.27,抑瘤率为(0.0±0.0)%;sh MT1组的肿瘤重量为0.43±0.13,抑瘤率为(55.2±2.7)%,可以发现sh MT1组肿瘤体积及重量都明显降低。(2)sh NC组的Matriptase、MMP-9、E-cadherin的蛋白相对表达量分别为2.23±0.75、0.58±0.11、1.12±0.22;sh MT1组的Matriptase、MMP-9、E-cadherin的蛋白相对表达量分别为0.19±0.03、0.09±0.03、1.02±0.07,可发现sh MT1组中的MMP-9表达量明显降低,而E-cadherin的表达无显著差异。(3)sh NC组中Matriptase、MMP-9免疫反应阳性细胞指数分别为(85±6.78)%、(95±4.50)%;sh MT1组中Matriptase、MMP-9免疫反应阳性细胞指数分别为(15±2.45)%、(35±2.35)%,同样发现sh MT1组移植瘤组织中MMP-9表达量明显降低。而E-cadherin的表达在sh NC组及sh MT1组中无明显差异。结论:沉默Matriptase在裸鼠胰腺癌移植瘤体内可抑制肿瘤的生长与转移,其机制可能与MMP-9的下调有关。
【学位单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R735.9
【部分图文】：

图 1：Matriptase 的分子结构示意图究发现 Matriptase 可以与肝细胞生长因子前体（pro-HGF）[7-9]、尿激-uPA）[10]、蛋白酶激活受体 2（PAR-2）[11]等底物结合，通过活化上述的蛋胞的生物学行为，从而调节细胞的生理功能，如维持上皮细胞的完整性、、促进细胞的迁移与神经细胞的分化，也可调节血管内皮细胞的迁移[12]等多研究发现 Matriptase 与上皮来源的实体肿瘤密切相关。Matriptase 最胞中被发现，在前列腺[13]、结肠[14]、肾脏[15]、肝脏[16]、肺脏[17]和卵巢[瘤均能检测到 Matriptase 的过表达，部分肿瘤中，Matriptase 高表达与级及临床预后不良密切相关，如宫颈癌[19]、乳腺癌[20]等。已有研究者分析胰腺癌的组织标本，发现 Matriptase 在胰腺恶性组织中的表达明显织，且在应用 Matriptase 抑制剂后发现 pro-uPA 酶原活化降低，并/cMet 的磷酸化并降低细胞的侵袭能力[21-22]。PA（urokinase-type plasminogen activator）是尿激酶型纤溶酶激活物的简

图 2：细胞侵袭实验示意图室准备：提前一夜将 Matrigel 胶置于 4℃过夜溶解，将每个孔中，将 Matrigel 胶用无血清 DMEM 1:8 稀释，每Matrigel 胶（注：不能有气泡），37℃培养箱中干燥 30 min胞的准备：将已经转染 NC-siRNA 和 Matriptase-siRNA0 用胰酶消化，1,000 rpm 离心 5 min，用无血清的 DME计数，按每小室 1×104个细胞加入上室中，每小室 20FBS 的 DMEM 培养基，37℃、5%CO2培养箱中培养 2晶紫染色并计数：取出小室，吸弃上室中的培养基，24 孔甲醇，小室置于其中固定 10 min，水洗三遍；结晶紫染再用棉签将小室内未穿过的基底膜的细胞擦拭掉，晾干个小室取 5 个视野，计数小室下层膜表面穿过膜的细胞

沉默 Matriptase 对胰腺癌细胞株 SW1990 及移植瘤生长的影响 第一部分AMatriptaseGADPHB C D图 4：Western blot 检测转染 NC 及不同浓度 Matriptase-siRNA 后 Matriptase 表达水平，A:NC 组；B：12.5 nM；C：25 nM；D：50 nM表 5：各组处理组 Matriptase 蛋白与 GAPDH 灰度值比值（n=3， ±s）组别 Matriptase 蛋白/GAPDHA(对照组） 0.74±0.06B（12.5 nM） 0.49±0.04**C（25 nM） 0.34±0.10**
【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 周国中,李兆申,邹晓平;胰腺癌病因流行病学研究现状[J];肿瘤防治杂志;2002年03期

本文编号：2845521