用于肝癌个体化治疗的三维药敏试验方法研究

发布时间：2020-10-19 21:08

　　 背景:肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,在全球所有恶性肿瘤相关死因中高居第二位。化疗是肝癌非手术治疗最常用的方法,然而目前仍然没有明确的证据表明任何一种化疗方案优于其他方案。由于肿瘤异质性的广泛存在,临床医生在选用化疗方案时往往仅凭个人经验,导致肝癌化疗疗效的不确定性,有关资料显示肝癌经验性化疗的有效率甚至不足30%。在“精准医疗”(precision medicine)模式的推动下,肝癌个体化治疗越来越受到人们的重视。而一系列临床研究也相继证实了肿瘤药敏试验(chemosensitivity test,CST)对于肝癌个体化治疗具有重要的指导意义。然而,由于缺乏高级别的临床证据,人们对肿瘤药敏试验应用于临床实践依旧持谨慎的态度。传统的肝癌药敏试验大多采用二维培养法,不能很好地模拟肿瘤细胞在体内的微环境,使得药敏试验结果无法真实反映肝癌患者对化疗药物的敏感性。另一方面,肝癌药敏试验缺乏统一的技术标准,各研究中心的药敏结果评判标准各不相同,极大地限制了肝癌药敏试验的推广。鉴于此,一种基于三维培养系统的、采用准确可靠的药敏评判标准的药敏试验方法是肝癌个体化治疗未来的一大研究方向。目的:发明一种成本较低、简单易行、稳定可靠的三维药敏试验方法,为肝癌个体化化疗提供重要指导。方法:第一章三维培养系统的构建与评价以商品化的三维培养系统GravityPLUS和AggreWell为借鉴设计模具,并用SOLIDWORKS 2016软件绘制倒模图,通过应用3D打印技术和注塑法构建三维培养系统。然后用三维培养系统对C3A细胞进行聚球培养,同时以二维培养组作为对照,动态观察两组细胞的形态学变化及检测其白蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、乳酸脱氢酶(LDH)水平。第二章人原代肝癌细胞的三维药敏试验采用胶原酶消化法和Percoll密度梯度离心法分离和纯化人原代肝癌细胞,并用台盼蓝拒染法和免疫荧光染色进行计数和鉴定。用第一章构建的三维培养系统对分离得到的人原代肝癌细胞进行聚球培养,同时以二维培养组作为对照,动态观察两组细胞的形态学变化。最后分别用八种化疗方案处理两组细胞,并用CCK-8法检测细胞活力,通过敏感度分级、敏感指数和联合指数三个指标对药敏结果进行综合评价。结果:第一章三维培养系统的构建与评价制作的PDMS模具具有良好的均一性,微孔均呈球形,无明显锯齿化。C3A细胞在接种三天后即可聚集成球,细胞球直径因接种密度而异,最终可占满整个微孔达到400μm。对C3A细胞的功能动态检测显示三维培养组的ALB、BUN水平明显高于二维培养组,反映三维培养组的合成功能和解毒功能优于二维培养组;而作为肝功能损害敏感指标的ALT、AST和LDH水平三维培养组总体低于二维培养组。第二章人原代肝癌细胞的三维药敏试验成功分离的两例人原代肝癌细胞活率和纯度分别大于90%和85%。两例人原代肝癌细胞在接种至三维培养系统三天后即可聚集成球,且绝大多数散在细胞均能迁移至微孔中,成球效果明显优于C3A细胞。药敏结果显示,对于第一例人原代肝癌细胞(ID:2652968),二维培养组对ADM+DDP的联合方案最敏感,而三维培养组对八种方案均耐药;对于第二例人原代肝癌细胞(ID:2685241),二维培养组对ADM+DDP的联合方案最敏感,而三维培养组对GEM+OXA最敏感。结论:本课题通过应用3D打印技术和注塑法构建的三维培养系统优于传统二维培养系统,尤其适合人原代肝癌细胞的聚球培养。结合CCK-8法和敏感度分级、敏感指数及联合指数三个指标能够很好地评价人原代肝癌细胞对不同药物的敏感性。在我们的实验中,人原代肝癌细胞二维及三维药敏结果存在较大差异,三维培养组对同一化疗方案的敏感性普遍低于二维培养组,与文献报道相符。该肝癌三维药敏试验方法具有成本低廉、操作简便、可重复利用、成球效果良好、适合高通量药物筛选等优点,提高了检测的准确性和稳定性,能够更合理地指导临床科学用药,为肝癌个体化治疗提供重要参考。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.7
【部分图文】：

图１－２?维培养系统培养孔剖面图??Ｆｉｇ?１－２?Ｃｒｏｓｓ－ｓｅｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?３Ｄ?ｃｕｌｔｕｒｅ?ｓｙｓｔｅｍ?ｗｅｌｌ??

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将ＳＯＬＩＤＷＯＲＫＳ?２０１６软件中的设计图另存为．ｓｔｌ文件，导入Ｒｅｔｉｎａｃｒｅａｔｅ??软件做进一步处理（如设置参数，生成支撑等），然后将生成的．ｆｓｌｊｏｂ２文件拷入??Ｕ盘（图１－５）。调平Ｐｈｏｅｎｉｘ?Ｔｏｕｃｈ?Ｐｒｏ?ＵＶ－ＬＥＤ?３Ｄ打印机，取下树脂槽，并倒??入光敏树脂（光敏树脂需充分摇匀，至少两分钟），注意倒入光敏树脂不可超过??树脂槽固定架上的刻度，否则光敏树脂可能在３Ｄ打印机工作时溢出。将Ｕ盘插??入３Ｄ打印机的ＵＳＢ接口，点击Ｕ盘绿色按钮，进入Ｕ盘文件界面，选择文件??及树脂类型开始打印（图１－６）。由于倒模较大，打印过程中可以暂停以添加光??敏树脂。打印完成以后（约需２７小时），小心将成型托盘取出，取出前使用一??张ｌ〇Ｃｍｘｌ５ｃｍ的纸挡住托盘下方以防光敏树脂溅落到机器内部损坏机器。用小??平铲铲下成型托盘底面的倒模，用９５％的医用酒精冲洗和浸泡倒模。最后去除??支撑并打磨倒模（图１－７）。??１６??
【参考文献】

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1 成琳;黄文斌;赵有财;赵建华;王劲松;;Arg-1、HepPar-1、GPC3和AFP检测在肝细胞癌诊断中的价值[J];诊断病理学杂志;2015年10期

2 吴孟超;汤钊猷;刘彤华;丛文铭;步宏;陈杰;董辉;朱玉瑶;冯龙海;陈骏;;原发性肝癌规范化病理诊断指南(2015年版)[J];临床肝胆病杂志;2015年06期

3 刘小珍;郑智国;凌志强;;肿瘤细胞原代培养与保存[J];中国肿瘤;2015年04期

4 罗南书;罗南英;;体外肝细胞培养及在药物筛选中的应用[J];中国生物医学工程学报;2015年01期

5 林满洲;胡敏;吴桂林;缪辉来;朱润芝;黄海丽;李明意;;组织薄片法在人原代肝癌细胞培养中的应用[J];岭南现代临床外科;2014年03期

6 聂磊;吴东德;张峰;夏晓勤;;化疗药物敏感试验在肝细胞癌患者化疗中的应用[J];临床肝胆病杂志;2013年08期

7 王士群;朱宇珍;郑学宝;;Chou-Talalay在抗肿瘤联合用药中的研究应用概况[J];中国现代应用药学;2013年04期

8 赵逸超;汪艳;卢海;简国登;潘明新;高毅;;一种适合肝细胞生长的无血清培养基[J];中国组织工程研究;2012年11期

9 柏帅;刘卫;聂磊;张志国;魏强;;消化道肿瘤细胞与外周血淋巴细胞体外药敏试验相关性的研究[J];中华肿瘤防治杂志;2011年19期

10 安军;付维利;丁洁;;L-谷氨酰胺与肝脏大部分切除后的再生[J];中国组织工程研究与临床康复;2011年31期

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1 李杰;Arginase-1、Glypican-3、Hepatocyte paraffin antigen 1及α-fetoprotein在肝脏肿瘤诊断与鉴别诊断中的意义[D];中国人民解放军医学院;2012年

2 王威;进展期胃癌原发灶、转移灶及外周血淋巴细胞体外药敏相关性研究[D];河北医科大学;2007年

3 楼朝阳;人肝癌细胞系FHCC-98的建立及其生物学特性研究与体外药理实验[D];第四军医大学;2004年

本文编号：2847731