FEN1功能以及作为抗肿瘤靶点的可行性研究

发布时间：2020-10-19 23:48

　　 FEN1是一种多功能、结构特异性的核酸酶,它在维持基因组稳定性上起着重要的作用。体内FEN1的合理调控对维持细胞正常生长是至关重要的。我们通过寻找与FEN1相互作用的蛋白而进一步深入探究FEN1未知的功能。我们尝试串联亲和纯化等方法获得了与FEN1相互作用的蛋白混合物并通过质谱进行鉴定。我们发现HSP70与FEN1相互作用并促进FEN1的活性和BER的效率。近来,我们在人类癌症样本中发现了 FEN1的突变,这暗示着突变可能会影响基因组的不稳定性并导致癌症的发生。然而,FEN1功能缺失和癌症易感性之间的确切关系仍然不清楚。我们利用与结直肠癌相关的突变体,并分别从分子生化水平、细胞水平和动物模型三个层面对癌症发生的相关机制进行了阐述。首先我们构建FEN1点突变,并表达纯化重组蛋白。我们在体外分析了重组蛋白对DNA底物的酶切活性以及结合力,发现这一突变失去FEN1的FEN、EXO和GEN活性但仍然保留与DNA的结合亲和力。接下来我们分析了 L209P突变与野生型FEN1共存对其酶活性的影响,结果发现该突变以一种dominant-negative的方式影响野生型FEN1的功能。最后我们在体外比较了SW480细胞的BER修复能力并同时用重组蛋白进行了 LP-BER的重建。结果发现该突变影响体外以及细胞内的BER效率。我们还研究了 L209P突变在细胞水平的变化。过表达L209P突变使得SW480细胞对5-FU和H202的敏感性更高并且其细胞凋亡比例增加。过表达L209P突变的SW480细胞的内源性损伤增加,表现为DNA双链断裂增加。并且该突变导致细胞内出现更多的染色体畸变,包括细胞内异倍体和染色体断裂的频率增加。此外,我们发现含L209P突变的细胞具有更高的克隆形成能力,并且突变细胞在小鼠异源生长模型上肿瘤形成能力更强。综上所述,与癌症相关的FEN1基因的变异会影响机体的BER修复效率,并诱导细胞发生转化。对该突变体的研究揭示了癌症发生的分子机制。基于以上的研究发现,FEN1功能对于正常细胞来讲是必要的,FEN1功能缺失将导致肿瘤发生。然而,与此同时,在己经转化成肿瘤的细胞中,其FEN1的表达水平远远高于正常细胞。我们发现在乳腺癌细胞中FEN1是高表达的,并且FEN1对于快速生长的癌细胞是必须的。我们发现改变FEN1在细胞中的表达水平会改变癌细胞对于化疗药物的反应。并且,对临床肿瘤样本的分析发现,肿瘤中FEN1表达水平越高,肿瘤恶性程度就越高,病人的预后就越差。在细胞中抑制FEN1活性会引起DNA复制停滞和未修复的DNA中间体的积累,进而导致DNA双链断裂和细胞凋亡。因此,我们认为,抑制FEN1活性将会抑制肿瘤细胞生长。基于这一设想,我们提出了以FEN1为靶点的抗肿瘤的策略。我们设计了一种全新的FEN1抑制剂(SC13),它可以特定的抑制FEN1的活性,并且影响冈崎片段的成熟和LP-BER,影响体内和体外的DNA复制和修复。SC13抑制癌细胞增殖,并导致细胞内DSBs和染色体断裂的产生,癌细胞中染色体的不稳定性进一步会诱导细胞发生凋亡。SC13和化疗药物联合使用会增加癌细胞中的DSBs的频率。更为重要的是,在用于小鼠的抗肿瘤实验中,SC13表现出良好的抗肿瘤效果。当SC13与化疗药物联合使用时,肿瘤抑制效果是比较明显的,表明SC13联合使用会增加癌细胞对化疗药物的敏感性。这些发现可以为乳腺癌和其他癌症的治疗提供参考。
【学位单位】：南京师范大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R730
【部分图文】：

１三种活性的底物模式图。箭头的大小和粗细程度代表不同活性强度。红色ＥＮ活性，蓝色箭头代表ＥＸＯ活性，橙色代表ＧＥＮ活性。??ｈｒｅｅ?ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ?ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ?ｏｆ?ＦＥＮ１．?Ｔｈｅ?ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｉｔｈ?ｖａｒｉｏｕｓ?ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ．?ＦＥＮ１?ｐｏｓｓｅｓｓｅｓ?ｔｈｒｅｅ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ，?ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ?ＦＥｃｔｉｖｉｔｙ．?Ｔｈｅ?ｓｉｚｅ?ａｎｄ?ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ?ｏｆ?ａｒｒｏｗｓ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ?ｔｈｅ?ｓｔｒｅｎｇｔｈ?ｏｆ?ｔｈｅ?ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．?Ｃｏｌｅｓｅｎｔｓ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．?Ｒｅｄ，?ｆｌａｐ?ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ?ａｃｔｉｖｉｔｙ；?ｂｌｕｅ，?ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ?ａｃｔｉｖｉｔｙｃｌｅａｓｅ?ａｃｔｉｖｉｔｙ．??Ｎ１与底物结合的晶体结构??关于ＦＥＮ１结构的描述出现在噬菌体同系物中，Ｔ５?５＃亥酸外切酶是带蛋白质，允许单链ＤＮＡ?（ｓｓＤＮＡ）通过ｐ３］。与生化数据一致的是，菌的晶体结构数据表明，ＦＥＮ１通过围绕疏水楔而优先结合悬置的ｌｎｔ大小的３＇－ｆｌａｐ和５＇－ｆｌａｐｐ４］。酶的这种构结构的底部，并引导它允许ＦＥＮ１精确地切割ｌｎｔ直至下游双链区切口＿。??ｒａｉ等人［３１］对人源ＦＥＮ１做了进一步的研究，确认ＦＥＮ１主要识别３＇－，。近，Ｔｓｕ

?第１章绪论?；???虽然在ＨＤ患者中没有发现功能缺陷的ＦＥＮ１突变体，然而其他证据表明，ＦＥＮ１??可以抑制重复序列的扩增［９７］。将包含ＴＯＲ重复序列的片段结构底物与ＤＮＡ?ｌｉｇａｓｅ?Ｉ??和ＦＥＮ１同时孵育，发现ＦＥＮ１浓度增加会抑制环状和发夹结构中间体的形成，这些??中间体可以形成ＴＮＲ扩增，这样ＦＥＮ１就间接的抑制了?ＴＮＲ的扩增［９８］。在酿酒酵母??中，ＦＥＮ１的缺乏大大增加了?ＴＮＲ的扩增，遗传分析表明ＦＥＮ１的ＥＸＯ和ＧＥＮ活??性均会抑制ＴＮＲ的扩增［９９］。Ｌｉｕ和Ｗｉｌｓｏｎ提出，重复扩增机制之一是ＬＰ－ＢＥＲ过程??中单链中间体上发夹结构的形成［１％。这些结构可以发生滑移，同时片段结构也跟着??滑动，使得ＦＥＮ１在错误的位置切割，剩余的ＴＮＲ序列由连接酶连接留在了?ＤＮＡ中??并导致了?ＴＮＲ的扩增。类似的ＴＮＲ扩增过程在冈崎片段中间体形成时也可能发生。??错配修复系统中蛋白发生突变也可以抑制ＴＮＲ扩增［１Ｑ１，Ｉ（）２］。最近的研宄表明，错配??修复复合体Ｍｓｈ２－Ｍｓｈ３可以稳定泡状结构和发夹结构，导致ＦＥＮ１在不适当的地方??进行切割，这似乎也会导致ＴＮＲ重复扩增１１（）３］。??〇??

ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，?ｂａｓｅｄ?ｏｎ?ｔｈｅ?ｋｎｏｗｎ?ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ?ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ?ａｎｄ?ｐａｔｈｗａｙｓ?ｏｆ?ｔｈｅｓｅ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ．??１．３．２?ＦＥＮ１在细胞内的区室化??细胞内定位是ＦＥＮ１功能调节的主要方式之一（图１．４）［１３５］。在真核细胞内，ＦＥＮ１??合成之后必须移到核内才能发挥功能［１３６］。最初的序列分析发现真核ＦＥＮ１的Ｃ末端??有一信号序列，推测为核定位信号（ｎｕｃｌｅａｒ?ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ?ｓｉｇｎａｌ，ＮＬＳ），引导蛋白从细??胞质进入核内。通过点突变发现有两组带正电荷的残基ＫＲＫ?（Ｌｙｓ－３５４、Ａｒｇ－３５５、??Ｌｙｓ－３５６）和?ＫＫＫ?（Ｌｙｓ－３６５、Ｌｙｓ－３６６、Ｌｙｓ－３６７）是?ＦＥＮ１?核定位信号的关键残基［１７］。??同时也发现在细胞周期的Ｓ期和发生ＤＮＡ损伤时会诱导更多ＦＥＮ１进入细胞核［１７］。??近来首次发现，ＦＥＮ１在核仁中聚集，在参与停滞的ＤＮＡ复制叉分解和维持核糖体??ＤＮＡ?（ｒＤＮＡ）的稳定性中起着重要的作用［１１５］。紫外照射（ＵＶ处理）之后，ＦＥＮ１??发生磷酸化后从核仁移到核浆
【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 李文送;;DNA甲基化及其生物学功能[J];生物学教学;2014年09期

2 刘庆华;茹慧香;;“DNA是主要的遗传物质”教学设计[J];中学生物教学;2016年07期

3 丁思思;袁华;罗小虎;李高峰;;植物DNA粗提取与鉴定的简便方法[J];中学生物教学;2016年19期

4 周苑;;《DNA分子的结构》微课程设计[J];中国信息技术教育;2016年24期

5 吴久宏;;追寻人类思维的脉络——苏教版“DNA分子的结构”一节科学史料教学设计[J];中学生物教学;2016年21期

6 唐琳;;《DNA是主要的遗传物质》教学设计(第一课时)[J];课程教育研究;2016年35期

7 王佳惠;;“观察DNA和RNA在细胞中的分布”实验改进[J];中学生物教学;2016年18期

8 刘雪梅;;作图法解决“放射性同位素标记DNA与细胞增殖”问题[J];中学生物教学;2016年18期

9 陈云;;“DNA是主要的遗传物质”一节的教学设计[J];生物学教学;2017年02期

10 霍静;李妞妞;曾令江;;提高“DNA粗提与鉴定”实验开出率的思考与探索[J];生物学教学;2017年02期

相关博士学位论文 前10条

1 孙洪芳;FEN1功能以及作为抗肿瘤靶点的可行性研究[D];南京师范大学;2018年

2 周文姣;基于酶辅助信号放大和DNA自组装纳米结构的生物标志物传感研究[D];西南大学;2018年

3 王丹;DNA损伤应答中长非编码RNA LRIK、ncRNA0301及蛋白质XPF的功能研究[D];湖南大学;2018年

4 苏晨鹤;Ⅰ型单纯疱疹病毒HSV-1皮层蛋白UL41逃逸宿主DNA识别信号通路抗病毒天然免疫的分子机制[D];苏州大学;2017年

5 吴琼;多功能声敏剂结合超声波照射损伤DNA的研究[D];辽宁大学;2018年

6 吴丹;CRISPR/C2c1的结构与功能机制研究[D];哈尔滨工业大学;2017年

7 陈勇;53BP1与微小染色体维持蛋白复合物参与人肝癌细胞DNA损伤修复的机制研究[D];南方医科大学;2018年

8 田茜;黄单胞菌属DNA条形码筛选及其重要致病变种检测技术研究[D];中国农业科学院;2018年

9 王倩倩;双加氧酶Tet对DNA甲基化修饰的影响及相关调控机制研究[D];中国农业大学;2018年

10 吴成超;序列复杂度方法在DNA调控元件预测中的应用研究[D];华中农业大学;2018年

相关硕士学位论文 前10条

1 田鹤枫;Fe_3O_4@Au纳米复合材料的合成及对质粒DNA的纯化研究[D];四川农业大学;2015年

2 李晓燕;表面活性剂对DNA空间结构及其液晶态影响的研究[D];西北大学;2018年

3 何美林;慢性HBV感染患儿血清preS1-Ag、HBVM及HBV-DNA检测结果分析[D];重庆医科大学;2017年

4 孟冬梅;乙型肝炎病毒标志物及DNA定量检测在慢性HBV感染进程中的临床意义[D];华北理工大学;2018年

5 杨国庆;基于球形核酸DNA链取代反应的端粒酶活性荧光检测[D];南京师范大学;2018年

6 胡中培;骨架磷硫修饰DNA在溶液中三维结构的初步研究[D];华中师范大学;2013年

7 朱小静;长江河口大型底栖动物及游泳动物DNA条形码研究[D];华东师范大学;2018年

8 石海燕;基于双链特异性核酸酶信号扩增的纳米传感器检测microRNA[D];河北大学;2018年

9 刘慧龙;新型高灵敏免修饰液晶型DNA生物传感器及其应用[D];重庆医科大学;2018年

10 朱斌;DNA损伤修复基因对农杆菌介导水稻遗传转化的影响[D];浙江大学;2017年

本文编号：2847879