G3BP1在肾癌增殖和转移中的作用研究
发布时间：2020-10-20 08:14
目的及内容:肾癌又称为肾腺癌或肾细胞癌(Renal cell carcinoma,RCC),起源于肾实质泌尿小管上皮系统,是泌尿系统最常见的恶性肿瘤。肾癌的临床症状不典型,约30%的患者在诊断时已经发展成转移性肾癌。肾癌的治疗较困难,尽管外科手术联合免疫治疗作为一种新兴的治疗手段,但它仍没有达到满意的治疗效果。因此,深入研究RCC增殖和转移的分子机制,探索新的转移性肾癌治疗靶点是RCC研究的至关重要任务。Ras-GTP酶激活蛋白Src同源结构域3结合蛋白1(Ras-GTPase-activating protein SH3 domain binding protein,G3BP1)在多种肿瘤中过表达,包括乳腺癌、胃癌、结肠癌和肝癌等,但其在肾癌中的作用尚未见报道。本研究将检测G3BP1在RCC中的表达情况,及其表达与肾癌临床病理参数间的相关性,探讨G3BP1在体外和体内对RCC细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响,初步明确G3BP1在调控肾癌增殖和转移中的相关分子机制。方法:1.应用Western blot和免疫组化的方法检测G3BP1在肾癌组织和其相对应的癌旁组织中的表达情况;统计学分析G3BP1表达与肾癌临床病理参数之间的相关性。2.应用慢病毒介导的RNA干扰技术构建G3BP1稳定降表达的肾癌ACHN和A498细胞系,Western blot和实时荧光定量PCR方法检测其蛋白质和mRNA的表达水平。3.应用CCK8实验检测G3BP1降表达对肾癌细胞ACHN和A498增殖能力的影响。4.应用Western blot检测G3BP1降表达对细胞增殖相关蛋白c-myc、cyclin D1表达的影响。5.应用迁移实验、Matrigel侵袭实验和EGF诱导的趋化运动实验检测G3BP1降表达对肾癌细胞ACHN和A498迁移能力、侵袭能力和EGF诱导的趋化运动能力的影响。6.应用Western blot和免疫荧光实验检测G3BP1降表达对上皮间质转化相关蛋白表达的影响。7.应用双荧光素酶报告基因实验筛选G3BP1降表达影响肾癌增殖和转移的相关信号通路分子。8.应用Western blot检测G3BP1在调控肾癌增殖和转移过程中的分子机制。9.应用Western blot检测G3BP1、p-STAT3及IL-6在临床肾癌组织和相对应的癌旁组织中的表达,统计学分析G3BP1的表达与p-STAT3及IL-6表达的相关性。10.应用小鼠活体成像技术研究G3BP1降表达对肾癌ACHN细胞原位异种移植瘤增殖和肝肺转移的影响。结果:1.Western blot和免疫组化检测发现,与相对应的癌旁组织相比,G3BP1在肾癌组织中表达增高,且G3BP1表达与TNM分期和Fuhrman分级相关(*P0.05),而与患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位和肿瘤坏死等因素无关。2.应用慢病毒介导的RNA干扰技术成功建立G3BP1稳定降表达的肾癌细胞ACHN和A498系,Western blot和实时荧光定量PCR检测G3BP1的蛋白质和mRNA表达水平(**P0.01)均明显下降。3.G3BP1降表达的肾癌细胞ACHN和A498与对照组相比增殖能力均显著降低(**P0.01)。4.G3BP1降表达的肾癌细胞ACHN和A498与对照组相比,细胞增殖相关蛋白c-myc和cyclin D1表达水平均明显下降。5.G3BP1降表达的肾癌细胞ACHN和A498与对照组相比,迁移能力、Matrigel侵袭能力和EGF诱导的趋化运动能力均显著降低(**P0.01)。6.G3BP1降表达的肾癌细胞ACHN和A498与对照组相比,上皮间质转化相关蛋白的上皮细胞标志E-cadherin表达水平明显升高,而间质细胞标志N-cadherin、Vimentin、Snail和Snail表达水平明显减低。7.G3BP1降表达的肾癌细胞ACHN和A498与对照组相比,p-STAT3信号通路的活性受到明显抑制(**P0.01)。8.G3BP1降表达的肾癌细胞ACHN和A498与对照组相比,p-STAT3蛋白表达水平明显降低;G3BP1降表达显著抑制IL-6对下游信号分子STAT3的活化,从而抑制肾癌细胞的迁移和侵袭能力(**P0.01);STAT3的特异性抑制剂stattic不影响G3BP1的表达。9.与相对应的癌旁组织相比,肾癌组织中G3BP1、IL-6和p-STAT3的表达均升高(*P0.05),且G3BP1的表达与IL-6和p-STAT3的表达显著相关(**P0.01)。10.G3BP1降表达组与对照组相比,肾脏原位肿瘤部位和肝肺转移灶部位的荧光强度降低,且肾脏原位肿瘤体积较小,形成的肝肺转移灶数目也明显比对照组少(**P0.01)。结论:1.G3BP1在肾癌组织中高表达,且能够促进肾癌增殖和转移。2.G3BP1降表达后,通过抑制c-myc和cyclin D1等细胞增殖相关蛋白的表达来抑制肾癌细胞增殖。3.G3BP1降表达后,通过抑制EMT来抑制肾癌细胞转移。4.G3BP1降表达后,p-STAT3信号通路的活性受到明显抑制;G3BP1降表达能够显著抑制IL-6对下游信号分子STAT3的活化,从而抑制肾癌细胞的迁移和侵袭能力。5.与相对应的癌旁组织相比,肾癌组织中G3BP1、IL-6和p-STAT3的表达均升高,且G3BP1的表达与IL-6和p-STAT3的表达显著相关。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.11
【部分图文】：
结果1 G3BP1 在肾癌组织中高表达我们首先通过 Western blot 检测 16 对 RCC 组织和其相对应的癌旁组织中G3BP1 的表达情况。结果表明，G3BP1 在 RCC 组织与癌旁组织相比表达增加（*P<0.05）（图 1 A，1 B）。为了进一步描述 G3BP1 的表达与 RCC 患者临床病理特点的相关性，我们收集了 43 例 RCC 患者，用 G3BP1 抗体进行免疫组织化学染色（图 1 C）。与 Western blot 结果一致，G3BP1 在 RCC 样本中高表达，表达率为 51.2%（22/43），而在相对应的癌旁组织中 G3BP1 表达率仅为 25.6%（11/43），且差异有统计学意义（P=0.0147，OR=3.048，95%CI 1.227-7.568）。进一步分析显示，在 RCC 患者中 G3BP1 的表达水平与 TNM 分期和 Fuhrman分级显著相关（*P<0.05）（表 1）。与此同时，G3BP1 的表达与其他临床病理特征，包括患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤坏死等无统计学差异（P>0.05）（表 1）。综上所述，我们的研究结果表明，G3BP1 在 RCC 中高表达且其表达水平与 RCC 进展有关。
图 2 G3BP1 降表达抑制肾癌细胞的增殖和转移。 A：左图为用 Western blot 验证 G3BP1 降表达稳定细胞系构建成功，其中 β-actin 作为内参；Naive 代表未转染组；Scr 代表导入空质粒Scr组；shG3BP1代表导入G3BP1降表达质粒组；右图为用实时荧光定量PCR检测G3BP1的 mRNA 表达情况，其中 GAPDH 作为内参；B：CCK8 实验检测 G3BP1 降表达对肾癌细胞增殖能力的影响，其中横坐标代表时间；纵坐标代表在 450nm 处的吸光度值；C：迁移实验检测 G3BP1 降表达对肾癌细胞迁移能力的影响，左图为肾癌细胞穿过 8μm 滤膜的代表图片（200×）；右图为计数穿过 8μm 滤膜的肾癌细胞数，纵坐标代表一个高倍镜视野下的细胞数；D：侵袭实验检测 G3BP1 降表达对肾癌细胞侵袭能力的影响，左图为肾癌细胞穿过铺上 Matrigel 胶的 8μm 滤膜的代表图片（200×）；右图为计数穿过铺上 Matrigel 胶的 8μm滤膜的肾癌细胞数，纵坐标代表一个高倍镜视野下的细胞数；E：EGF 诱导的细胞趋化实验检测 G3BP1 降表达对肾癌细胞趋化能力的影响，左图为肾癌细胞穿过 8μm 滤膜的代表图片（200×）；右图为计数穿过 8μm 滤膜的肾癌细胞数，纵坐标代表一个高倍镜视野下的细胞数；NS 代表 P>0.05，没有统计学意义；*代表 P<0.05；**代表 P<0.01。
34图3 G3BP1降表达抑制肾癌细胞增殖相关蛋白和上皮间质转化标志蛋白的表达。A：Westernblot 检测肾癌细胞增殖相关蛋白的表达情况；B：Western blot 检测肾癌细胞上皮间质转化标志蛋白的表达情况；C：免疫荧光检测肾癌 ACHN 细胞上皮间质转化标志蛋白的表达情况。4 G3BP1 降表达通过抑制 IL-6 对 STAT3 的活化来抑制肾癌细胞迁移和侵袭为进一步探索 G3BP1 调节 RCC 上皮间质转化潜在的分子机制，我们首先通过双荧光素酶报告基因实验筛选 G3BP1 降表达后可能影响的信号通路，包括STAT3、AP1、ISRE、TGFβ（p3TP）、P53、NFAT 和 WNT（TOPFlash）。结果表明 G3BP1 降表达后，多种肿瘤发生相关的信号通路活性受到抑制，包括STAT3、AP1 和干扰素（ISRE）信号通路等（图 4 A）。在这些信号通路中我们
【相似文献】
本文编号：2848439
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.11
【部分图文】：
结果1 G3BP1 在肾癌组织中高表达我们首先通过 Western blot 检测 16 对 RCC 组织和其相对应的癌旁组织中G3BP1 的表达情况。结果表明，G3BP1 在 RCC 组织与癌旁组织相比表达增加（*P<0.05）（图 1 A，1 B）。为了进一步描述 G3BP1 的表达与 RCC 患者临床病理特点的相关性，我们收集了 43 例 RCC 患者，用 G3BP1 抗体进行免疫组织化学染色（图 1 C）。与 Western blot 结果一致，G3BP1 在 RCC 样本中高表达，表达率为 51.2%（22/43），而在相对应的癌旁组织中 G3BP1 表达率仅为 25.6%（11/43），且差异有统计学意义（P=0.0147，OR=3.048，95%CI 1.227-7.568）。进一步分析显示，在 RCC 患者中 G3BP1 的表达水平与 TNM 分期和 Fuhrman分级显著相关（*P<0.05）（表 1）。与此同时，G3BP1 的表达与其他临床病理特征，包括患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤坏死等无统计学差异（P>0.05）（表 1）。综上所述，我们的研究结果表明，G3BP1 在 RCC 中高表达且其表达水平与 RCC 进展有关。
图 2 G3BP1 降表达抑制肾癌细胞的增殖和转移。 A：左图为用 Western blot 验证 G3BP1 降表达稳定细胞系构建成功，其中 β-actin 作为内参；Naive 代表未转染组；Scr 代表导入空质粒Scr组；shG3BP1代表导入G3BP1降表达质粒组；右图为用实时荧光定量PCR检测G3BP1的 mRNA 表达情况，其中 GAPDH 作为内参；B：CCK8 实验检测 G3BP1 降表达对肾癌细胞增殖能力的影响，其中横坐标代表时间；纵坐标代表在 450nm 处的吸光度值；C：迁移实验检测 G3BP1 降表达对肾癌细胞迁移能力的影响，左图为肾癌细胞穿过 8μm 滤膜的代表图片（200×）；右图为计数穿过 8μm 滤膜的肾癌细胞数，纵坐标代表一个高倍镜视野下的细胞数；D：侵袭实验检测 G3BP1 降表达对肾癌细胞侵袭能力的影响，左图为肾癌细胞穿过铺上 Matrigel 胶的 8μm 滤膜的代表图片（200×）；右图为计数穿过铺上 Matrigel 胶的 8μm滤膜的肾癌细胞数，纵坐标代表一个高倍镜视野下的细胞数；E：EGF 诱导的细胞趋化实验检测 G3BP1 降表达对肾癌细胞趋化能力的影响，左图为肾癌细胞穿过 8μm 滤膜的代表图片（200×）；右图为计数穿过 8μm 滤膜的肾癌细胞数，纵坐标代表一个高倍镜视野下的细胞数；NS 代表 P>0.05，没有统计学意义；*代表 P<0.05；**代表 P<0.01。
34图3 G3BP1降表达抑制肾癌细胞增殖相关蛋白和上皮间质转化标志蛋白的表达。A：Westernblot 检测肾癌细胞增殖相关蛋白的表达情况；B：Western blot 检测肾癌细胞上皮间质转化标志蛋白的表达情况；C：免疫荧光检测肾癌 ACHN 细胞上皮间质转化标志蛋白的表达情况。4 G3BP1 降表达通过抑制 IL-6 对 STAT3 的活化来抑制肾癌细胞迁移和侵袭为进一步探索 G3BP1 调节 RCC 上皮间质转化潜在的分子机制，我们首先通过双荧光素酶报告基因实验筛选 G3BP1 降表达后可能影响的信号通路，包括STAT3、AP1、ISRE、TGFβ（p3TP）、P53、NFAT 和 WNT（TOPFlash）。结果表明 G3BP1 降表达后，多种肿瘤发生相关的信号通路活性受到抑制，包括STAT3、AP1 和干扰素（ISRE）信号通路等（图 4 A）。在这些信号通路中我们
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本文编号：2848439
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