Nlrp3炎性小体介导结直肠癌肝转移进展的分子机制研究

发布时间：2020-10-22 02:02

　　 研究目的:研究和探讨巨噬细胞中的Nlrp3炎性小体通路介导结直肠癌肝转移进程的分子机制。实验方法:1.结直肠癌(CRC)细胞单独作用于巨噬细胞的检测:采用transwell迁移实验验证CRC细胞上清对巨噬细胞的趋化作用,CRC细胞上清孵育巨噬细胞48h后,用免疫荧光双染检测巨噬细胞是否有Nlrp3炎性小体的激活,并用QPCR方法检测巨噬细胞的Nlrp3和IL-1β表达量变化,采用ELISA方法检测巨噬细胞的IL-1β的释放量的变化。2.巨噬细胞与CRC共孵育后的检测:采用transwell迁移实验验证巨噬细胞与CRC共孵育后对结直肠癌细胞(SW480)是否具有进一步的促迁移作用;并用QPCR方法检测共孵育后结直肠癌细胞的上皮细胞-间充质转化(EMT)标志物和金属蛋白酶(MMPs)的表达量变化。3.IL-1β作用于CRC的检测:用不同浓度的IL-1β刺激CRC,采用transwell迁移实验验证IL-1β是否能促进CRC迁移,并用QPCR方法检测CRC的EMT标志物和MMPs的表达量变化。4.在共培养系统中加入Nlrp3、caspase-1抑制剂(或采用Nlrp3-/-、caspase-1-/-、鼠的骨髓细胞诱导的巨噬细胞系统),采用transwell迁移实验验证抑制剂(或基因敲除)是否能够抑制巨噬细胞的促迁移作用。5.体内实验:在C57小鼠脾脏种植MC38细胞进行肝转移模型的建立;观察Nlrp3-/-小鼠与WT小鼠肝转移情况的差异;采用免疫组化方法检测肝组织切片中的NLRP3蛋白的表达和分布情况。实验结果:1.迁移实验发现CRC上清对巨噬细胞具有趋化作用;CRC上清孵育巨噬细胞48h后,免疫荧光双染检测发现了巨噬细胞的Nlrp3炎性小体激活,且巨噬细胞的Nlrp3和IL-1β表达量上调,及IL-1β的释放量增加。2.迁移实验证明巨噬细胞与CRC共孵育后对结直肠癌细胞(SW480)具有进一步的促迁移作用。3.IL-1β能够促进结直肠癌细胞的迁移,并使结直肠癌细胞发生EMT的变化和MMP3的表达量的上调。4.在共孵育系统中,Nlrp3炎性小体通路通过不同种方法阻断或者封闭后,以上共孵育促迁移作用能被Nlrp3小体通路的抑制剂或基因敲除所削弱。5.在肝转移模型中发现Nlrp3-/-小鼠的肝脏转移灶要明显少于WT小鼠,肿瘤转移被抑制。结论:结直肠癌病人组织中发现,与肿瘤邻近的正常组织相比,肿瘤微环境中含更多的CD68+细胞且高表达Nlrp3蛋白。在体外实验中,肿瘤细胞能够趋化巨噬细胞,并能够诱导巨噬细胞Nlrp3炎性小体的激活,使巨噬细胞的IL-11β分泌增加,从而促进肿瘤细胞的迁移。巨噬细胞的这种促癌作用能被Nlrp3信号通路的抑制剂或基因敲除所抑制。在小鼠肝转移模型中,Nlrp3-/-小鼠的肝脏肿瘤灶明显少于WT小鼠,肿瘤转移被抑制。以上结果表明,Nlrp3炎性小体在结直肠癌转移起着重要作用,肿瘤微环境中的巨噬细胞与CRC相互作用后可以通过激活Nlrp3炎性小体进一步促进CRC的侵袭和转移。本研究可能为结直肠癌这一恶性疾病提供一种新的治疗策略。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.34
【部分图文】：

１９例结直肠癌病人的肿瘤组织切片取自南方医科大学病理科，我们对其中６??例进行了巨噬细胞标志物…ＣＤ６８及ＮＬＲＰ３蛋白的免疫荧光双染分析，结果如??图１－２所示，发现与邻近的正常组织相比，肿瘤微环境中含更多的ＣＤ６８＋细胞且??高表达ＮＬＲＰ３蛋白。提示肿瘤微环境中巨噬细胞的ＮＬＲＰ３炎症小体相关通路??可能在结直肠癌的发生发展中起到重要作用。??ＣＤ６８?ＮＬＲＰ３?ＤＡＰＩ??■■■■?■??■■■圔??图１－２．代表性病例肿瘤组织及其邻近正常组织的免疫荧光染色结果。??Ｆｉｇ．?１－２?Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ?ＩＦ?ｉｍａｇｅｓ?ｏｆ?ＮＬＲＰ３?ａｎｄ?ＣＤ６８?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｉｎ?ｐａｉｒｅｄ?ｔｕｍｏｒ?ａｎｄ?ａｄｊａｃｅｎｔ??ｔｉｓｓｕｅｓ．??１．５?小结??与肿瘤邻近的正常组织相比，结直肠癌的肿瘤微环境中含更多的ＣＤ６８＋细??胞且高表达Ｎｌｒｐ３蛋白。提示肿瘤微环境中巨噬细胞的Ｎｌｒｐ３炎症小体可能参与??了结直肠癌的发生发展，但其中的具体作用及分子机制需进一步探讨。??１０??

小鼠骨髓细胞经ＧＭ－ＣＳＦ诱导成巨噬细胞（ＢＭＤＭ），细胞贴壁生长，并伸出??伪足。我们采用Ｃｏｍｉｎｇ公司的ｔｒａｎｓｗｅｌｌ板检测结直肠癌上清对巨嗤细胞的趋化??作用，随机选取５个视野（２０〇Ｘ），趋化情况及统计结果如图２－１－２所示：图Ａ??显示，人源巨噬细胞（Ｍ？）在人源结直肠癌细胞（ＳＷ４８０）的趋化下，其迀移??能力明显增强，其迁移能力增强３倍以上，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．００１）；图??Ｂ显示，鼠源巨噬细胞（ＢＭＤＭ）在鼠源结直肠癌细胞（ＭＣ３８）的趋化下，其??迁移能力同样明显增强，其迁移能力增强５倍以上，差异具有统计学意义??（Ｐ＜０．００１）。同时，在ＣＴ２６细胞中同样出现相似的结果。这说明结直肠癌细??２５??

?ＢＭＤＭ＋ＭＣ３８?ＢＭＤＭ＋ＣＴ２６??图２－Ｍ．巨噬细胞与结直肠癌细胞共孵育示意图??Ｆｉｇ?２－１－１．?Ｔｈｅ?ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?Ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ?ｂｅｔｗｅｅｎ?ｍａｏｃｒｏｐｈａｇｅｓ?ａｎｄ?ＣＲＣ．??（２）结直肠癌细胞对巨噬细胞的趋化作用??ＴＨＰ－１经ＰＭＡ诱导分化为巨噬细胞（Ｍｅ），细胞贴壁生长，成葡萄串样。??小鼠骨髓细胞经ＧＭ－ＣＳＦ诱导成巨噬细胞（ＢＭＤＭ），细胞贴壁生长，并伸出??伪足。我们采用Ｃｏｍｉｎｇ公司的ｔｒａｎｓｗｅｌｌ板检测结直肠癌上清对巨嗤细胞的趋化??作用，随机选取５个视野（２０〇Ｘ），趋化情况及统计结果如图２－１－２所示：图Ａ??显示，人源巨噬细胞（Ｍ？）在人源结直肠癌细胞（ＳＷ４８０）的趋化下，其迀移??能力明显增强，其迁移能力增强３倍以上，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．００１）；图??Ｂ显示，鼠源巨噬细胞（ＢＭＤＭ）在鼠源结直肠癌细胞（ＭＣ３８）的趋化下，其??迁移能力同样明显增强，其迁移能力增强５倍以上，差异具有统计学意义??（Ｐ＜０．００１）。同时
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本文编号：2850934