血小板在肝癌门静脉癌栓形成中的作用机制研究

发布时间：2020-10-22 04:33

　　 研究背景肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是全世界范围内死亡率占第三位的恶性肿瘤,预后极差,主要原因之一是其容易侵犯临近的门静脉系统而形成门静脉癌栓(portal vein tumor thrombus,PVTT)。肝癌门静脉癌栓已成为制约肝癌预后的最大瓶颈问题。血小板(platelet,PLT)作为近年来肿瘤相关研究的热点,其在肝癌发生中的作用被逐渐认识,几乎参与了诸如肝脏炎症的损伤与修复、肝纤维化直至肝癌等慢性肝脏疾病的各个过程。但是,血小板与门静脉癌栓形成这一特殊的肝癌转移方式之间的关系尚未见报道。分析血小板在肝癌门静脉癌栓形成过程中的作用,不仅能为癌栓的形成机制做以新的阐释,更能为其治疗开辟新的思路。研究目的通过回顾性分析术前伴有不同血小板计数的肝癌门静脉癌栓患者的预后,建立血小板与门静脉癌栓之间的初步联系。进一步通过分析门静脉癌栓患者血小板活化情况及癌栓组织特异表达的基因谱,探讨血小板在肝癌门静脉癌栓形成中的重要作用,从而为肝癌门静脉癌栓的治疗寻找新的治疗靶点和方法。研究方法一、术前血小板计数与肝癌门静脉癌栓患者预后关系的分析以肝癌伴门静脉癌栓患者为研究对象,结合术前临床资料数据及预后生存状况,以术前血小板计数的高低将病人分为三组:血小板减少组(PLT100×109/L)、正常组(100×109/L≤PLT≤300×109/L)和升高组(PLT300×109/L)。回顾性分析患者的预后,以确定术前血小板计数对肝癌门静脉癌栓患者预后的影响。二、肝癌伴门静脉癌栓患者血小板活性检测分离提取肝癌伴和不伴门静脉癌栓患者的洗涤血小板,通过分析血小板的聚集能力差异,探讨肝癌门静脉癌栓患者的血小板活化状态改变情况。并进一步用血小板活化相关分子通过流式细胞技术加以验证。三、癌栓组织特异性m RNA表达谱分析取三例肝癌伴门静脉癌栓患者的配对新鲜组织样本,包括癌旁组织(pritumoral tumor,PT)、肝癌原发灶组织(parenchyma tumor,T)和门静脉癌栓组织(portal vein tumor thrombosis,PVTT/P),行基因芯片检测。分别分析不同病人间的个体化差异和各组织间的特异性表达差异。通过Metascape(http://metascape.org)分析差异基因参与的生物学功能及相关信号通路,并最终确定目的基因。四、目的基因诱导栓块形成促进肝癌门静脉癌栓发生的作用机制研究通过扩大样本量,确定目的基因在不同组织中的表达。进一步用不同肝癌细胞系与血小板共培养,建立体外“癌栓”形成模型,并结合细胞系的成栓能力及目的基因的表达水平确定体外研究的工具细胞系。再通过该模型对目的基因在门静脉癌栓形成中的机制做探讨。研究结果第一部分:门静脉癌栓患者血小板降低的的伴发比例较高(20.9%)。不同血小板计数患者之间的临床病理特征不同,肝硬化伴发率(p0.001)、肿瘤大小(p0.001)以及肿瘤是否存在包膜(p=0.032)差异明显。门静脉癌栓患者伴有血小板计数减少者的无瘤生存期RFS(recurrence free survival)和总体生存期OS(overall survival)均优于血小板计数正常组(p均小于0.001)和升高组(p=0.008和0.046),但血小板计数正常组和升高组之间无明显的统计学差异(p=0.578和0.877)。进一步通过倾向性匹配评分(PSM)排除各组间的病历资料差异的影响并作亚组分层,结果表明:II型门静脉癌栓患者中血小板减少组的患者的无瘤生存期明显优于血小板正常组(p=0.011),但I型癌栓和III型癌栓病人的不同血小板计数组之间无明显差别(p=0.154和0.142)。I型和II型癌栓中血小板减少组的患者的总体生存期的分析均优于血小板正常组(p=0.021和0.029),但III型癌栓患者的两组间仍无差异(p=0.451)。多因素风险回归分析结果表明血小板计数是肝癌门静脉癌栓患者预后相关的独立危险因素,包括无瘤生存期(hazard ratio[HR]0.602,95%CI 0.444-0.836,p=0.001)和总体生存期(HR 0.582,95%CI 0.415-0.816,p=0.002)。第二部分:通过分析肝癌伴和不伴门静脉癌栓患者的洗涤血小板,结果表明肝癌伴门静脉癌栓患者的血小板聚集能力增强,血小板活化的比例增加。通过对肝癌伴门静脉癌栓患者配对的不同组织(癌栓组织、原发灶组织和癌旁组织)行基因芯片检测发现,病人之间存在交大的个体化差异;进一步汇总分析三例病人均有差异的基因显示:三种组织各自具有其独特的基因表达谱。将差异基因在基因功能网站进行分析发现,癌栓组织中特异表达的基因在细胞溶解、一元羧酸酸代谢、胰岛素样生长因子调节、小分子代谢以及有机羟基化合物运输等生物学功能上富集明显,且部分差异基因还与整合素信号通路和HNF3B信号通路等肿瘤相关的信号通路密切相关。进一步根据差异基因的表达水平及其生物学功能,最终将干细胞因子(SCF/KITLG)作为目的基因重点进行后续的机制研究。第三部分:通过扩大样本检测结果发现,目的基因KITLG在肝癌门静脉癌栓组织中表达明显高于肝癌原发灶组织和癌旁组织,此外,KITLG的受体基因c-KIT表达水平与其相一致,在门静脉癌栓组织中表达升高。进一步检测肝癌相关的干细胞标志物发现,Ep CAM、CD44、CD90和CD133在门静脉癌栓组织和肝癌原发灶组织中的表达均比癌旁组织高,除CD133在门静脉癌栓组织中与肝癌原发灶中表达水平相似外,Ep CAM、CD44和CD90的表达水平在癌栓组织中最高。不同肝癌细胞系中KITLG的表达水平不一样,来源与肝癌门静脉癌栓的细胞系CSQT-2中KITLG的表达水平最高。通过将CSQT-2与血小板共培养建立体外“癌栓”模型的实验结果表明,细胞系中KITLG的表达水平与成栓能力有关,KITLG是肝癌门静脉癌栓形成中的重要分子。结论1、血小板计数是肝癌门静脉癌栓患者预后的独立危险因素。伴血小板计数减少的肝癌门静脉癌栓患者预后相对较好;2、肝癌门静脉癌栓患者血小板活化增强;3、门静脉癌栓组织、肝癌原发灶组织和癌旁组织的基因表达存在差异,各有自身特异的基因表达谱;4、KITLG在肝癌门静脉癌栓组织中高表达,促进癌栓肿瘤细胞干性的维持,并可在体外诱导栓块形成而促进癌栓的发生。本课题创新点及潜在应用价值确定了血小板计数与肝癌门静脉癌栓的预后关系,为肝癌门静脉癌栓的临床治疗提供指导。通过基因芯片分析明确了癌栓组织特异性基因表达谱,并分析其分子功能及相关信号通路,为癌栓形成机制的相关研究提供数据支持和参考;进一步分析明确KITLG通过诱导栓块形成促进肝癌门静脉癌栓发生的机制,为抗血小板治疗在肝癌门静脉癌栓的应用提供有力证据。
【学位单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.7
【部分图文】：

学位论文录患者 694例，血小板正常者 527 例（75.9%），血小板小板升高者 22例（3.2%），血小板减少的伴发率远高于据研究的入组标准和剔除标准（表 1-1），最终共有 555 分析流程见图 1-1。在剔除的 139例患者中：IV型癌栓患疗者 43 例，合并有胆管癌栓和/或门静脉癌栓者 34例，数。入组的 555 例患者中血小板正常者 426 例（76.7%），.2%），血小板升高者 17例（3.1%），详细临床资料见表

图 1-2：所有入组病人中不同血小板计数组之间的 Kaplan-Meier生存分析。A：累积无瘤生存期，不同血小板计数组患者的累积无瘤生存期存在明显差异（p<0.001）；B：累积总体生存期，不同血小板计数组患者间的累积无瘤生存期存在统计学差异（p=0.001）三组伴有不同血小板计数的癌栓患者的中位无瘤生存期（RFS）总体生存期（OS）分别为：血小板正常组患者的中位 RFS 和 OS 分别为 1.87个月（95% CI（confidence interval，可信区间）, 1.672 – 2.068 月）和 8.77个月（95% CI, 7.902 –9.638 月）；血小板减少组癌栓患者的中位 RFS 和 OS 分别为 3.1 个月 （95 % CI，1.369 – 4.831 月）和 16.57 个月 ( 95% CI, 12.770 – 20.370 月)；血小板升高患者的中位 RFS 和 OS 则分别为 1.47个月（95% CI, 1.282 -1.658）和 9.7 个月（ 95% CI,7.051 -12.349 月）。进一步做 Kaplan-Meier 生存分析结果显示，三组病人之间的无瘤生存期和总体生存期存在明显差别，其 log-rank-χ 2 分别为 22.814 和 15.020，p值分别< 0.001 和 0.046（图 1-2）。分别对比两组间的差异显示，伴有血小板计数减少的癌栓患者无论是无瘤生存期和总体生存期均比血小板计数正常组和升高组的患者长（图 1-3A 和 B，图 1-3C

- 16 -图 1-3：不同血小板计数组的癌栓患者 Kaplan-Meier生存分析。A和 B分别为血小板减少组和血小板升高组之间的累积无瘤生存期（RFS）和总体生存期 OS）；C和 D分别为血小板正常组和血小板升高组之间的 RFS 和 OS；E和 F 分别为血小板正常组和血小板升高组之间的 RFS 和 OS。
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本文编号：2851098