精氨酸甲基转移酶PRMT7诱导乳腺癌细胞发生表皮—间质转换及转移的作用机制研究

发布时间：2020-10-22 03:59

　　 乳腺癌是女性最普遍的恶性疾病。与世界其他大多数国家一样,乳腺癌也是中国女性最常见的癌症,2008年,中国乳腺癌新发病例和死亡病例分别占全世界的12.2%和9.6%;而造成90%实体瘤病人死亡的根本原因是乳腺癌转移。乳腺癌远端转移是一个极其复杂的过程,它涉及到原位瘤细胞浸润并进入血液循环系统,在新的微环境中产生转移灶。然而乳腺癌是一种异质性的疾病,可以分为腔膜样型、基底细胞样型、HER2过表达型和正常乳腺样型等4种亚型。乳腺癌异质性的特征也使得对乳腺癌转移标准的评估产生了很大的风险,而且在治疗上也非常困难。表皮-间质转换(EMT)指的是在特定的生理或病理条件下,表皮样细胞转变为间质样细胞的过程。主要表现为细胞表面粘附分子(如:E-cadherin)表达降低,细胞极性丧失,细胞骨架发生重塑,细胞的迁移和侵袭能力增强。EMT过程是胚胎发育中的一种正常生理活动,随后也发现EMT在伤口愈合、炎症反应、组织重建、肿瘤转移等生物学过程中发挥重要作用。肿瘤细胞EMT发生导致细胞浸润能力增强,因此EMT也被认为是肿瘤细胞转移的起始步骤之一。在分子水平上,E-cadherin表达缺失是EMT发生的最重要标志事件。此外,很多转录因子,如Snail、Twist、ZEB1、ZEB2和FOXC2等均可以通过直接或间接的抑制E-cadherin启动子的活性诱导EMT发生。近年来,越来越多的研究表明:表观遗传修饰参与E-cadherin的转录调控过程。组蛋白去乙酰化酶HDAC1/2、组蛋白去甲基化酶LSD1、组蛋白甲基转移酶G9a和Suv39H1、以及DNA甲基转移酶等都可以抑制E-cadherin基因的转录。表观遗传修饰调控的失调与肿瘤发生密切相关,在该领域的研究有助于揭示人类肿瘤发生和转移的新机制。PRMT7属于精氨酸甲基转移酶家族的Ⅱ型成员,参与介导组蛋白或非组蛋白的对称性二甲基化修饰。已有的研究表明,PRMT7可以参与男性印记基因甲基化、核糖体RNA的组装、DNA损伤修复和细胞分化等多项生理活动。但是现在还没有关于PRMT7参与肿瘤发生或转移的报道。我们的免疫组化结果表明:PRMT7在乳腺癌组织中高水平表达;同时Oncomine数据库的分析也进一步证实了我们的结论。在细胞水平上,我们发现PRMT7在恶性乳腺癌细胞内高表达,而且过表达PRMT7可以诱导乳腺癌细胞发生EMT和转移。在过表达PRMT7诱导乳腺癌细胞发生EMT过程中,E-cadherin等表皮markers表达下调;而N-cadherin等间质markers表达上调。进一步研究发现,PRMT7能够抑制表皮marker E-cadherin启动子的转录活性,转录因子YY1能够与PRMT7和HDAC3直接结合,并招募二者到E-cadherin启动子上发挥转录抑制作用;在此过程中,PRMT7介导的H4R3me2s修饰水平在E-cadherin启动子上增加,同时伴随着H3K4me3、H3Ac和H4Ac修饰水平的减少。相反,降低PRMT7表达后,E-cadherin水平有所恢复,这主要是因为E-cadherin启动子上H4R3me2s修饰减少,而H3K4me3和H4Ac修饰增加。我们的研究表明精氨酸甲基转移酶PRMT7是乳腺癌发生转移的一个重要诱导因子,同时我们也揭示了乳腺癌细胞发生EMT和转移的一种新的表观遗传调控机制。该研究成果为开发靶向PRMT7治疗转移性乳腺癌提供了重要理论基础。
【学位单位】：东北师范大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R737.9
【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
第一部分 研究背景
    一、表皮-间质转换与肿瘤转移的关系
        （一） 表皮-间质转换
        （二） 肿瘤细胞转移
        （三） EMT与乳腺癌转移的关系
    二、EMT的表观遗传调控机制
        （一） EMT与DNA甲基化
        （二） EMT与组蛋白修饰
        （三） EMT与非组蛋白修饰
        （四） EMT与miRNAs介导的翻译后修饰
    三、人PRMT7 研究进展
        （一） PRMTs家族简介
        （二） PRMT7 的功能与作用机制
    四、转录因子YY1 和去乙酰化酶HDAC3 的研究进展
        （一） YY1 的发现
        （二） YY1 的功能
        （三）HDAC3 的研究概述
    五、本论文研究内容及意义
        （一） 立题依据
        （二） 研究内容及意义
第二部分 实验材料与方法
    一、实验材料
        （一） 实验仪器
        （二） 试剂
        （三） 抗体
        （四） 质粒
        （五） 细胞系
    二、实验方法
        Ⅰ、分子生物学实验方法
            （一） 表达质粒构建
            （二） 干涉质粒构建
            （三） 质粒提取方法
            （四） RNA提取、逆转录和Real-time PCR
            （五） 免疫印迹（Western Blot）
            （六） 免疫共沉淀实验（CoIP）
            （七）染色质免疫共沉淀实验（ChIP）
            （八） ChIP-re- ChIP实验
            （九）蛋白纯化及GST pull down实验
            （十） 免疫荧光实验（IF）
        Ⅱ、细胞生物学实验方法
            （一） 细胞培养
            （二） 细胞瞬时转染
            （三） 慢病毒的包装及侵染
            （四）报告基因检测
            （五）细胞迁移和侵袭实验
            （六）细胞划痕实验
            （七）明胶酶谱实验
            （八） MTT细胞活力检测
        Ⅲ、临床病理及活体实验
            （一）免疫组化实验（IHC）
            （二） 苏木精-伊红染色（HE）
            （三）裸鼠成瘤实验
            （四）裸鼠转移实验
        Ⅳ、统计分析
第三部分 实验结果与分析
    一、PRMT7 的表达与乳腺癌恶性程度正相关
        （一） PRMT7 在高转移的乳腺癌细胞内高表达
        （二） PRMT7 在乳腺癌组织中表达高于癌旁组织
    二、PRMT7 异常表达诱导EMT发生
        （一） PRMT7 过表达诱导乳腺表皮细胞发生EMT
        （二）PRMT7 过表达诱导乳腺癌细胞发生EMT
        （三）降低PRMT7 表达部分逆转EMT发生
    三、PRMT7 促进细胞迁移和侵袭
        （一） PRMT7 过表达增强细胞的迁移和侵袭能力
        （二）降低PRMT7 表达抑制细胞的迁移和侵袭
    四、PRMT7 介导的EMT进程中，E-cadherin启动子上表观遗传修饰的变化
        （一） PRMT7 抑制E-cadherin启动子的活性
        （二） E-cadherin启动子上H4R3me2s修饰水平增加伴随着H3K4me3 减少
        （三） H4R3me2s与组蛋白乙酰化修饰之间存在crosstalk
    五、YY1 招募PRMT7/HDAC3 复合物抑制E-cadherin的转录
        （一） PRMT7 与YY1 和HDAC3 存在于同一复合物中
        （二） YY1 与HDAC3 直接结合
        （三） YY1 招募PRMT7/HDAC3 到E-cadherin启动子进行转录抑制
    六、PRMT7 促进乳腺癌的远端转移
        （一） PRMT7 促进乳腺癌细胞的转移
        （二） PRMT7 抑制乳腺癌原位瘤的生长
第四部分 讨论
    一、PRMT7 与肿瘤转移
    二、表观修饰与EMT
    三、YY1-PRMT7-HDAC3 三元复合物
    四、EMT与肿瘤细胞干性
主要结论和创新点
    一、主要结论
    二、创新点
参考文献
附录一
附录二
附录三
致谢
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