课题组前期研究证实:肿瘤细胞释放自噬小体(TRAP)通过TLR2-MyD88-NF-κB信号途径诱导B细胞成为分泌高水平IL-10的调节性B细胞(IL-10~+Breg细胞),并依赖IL-10抑制T细胞的活化及其抗肿瘤作用;同时发现:TRAP能通过TLR4-MyD88-p38信号通路诱导单核/巨噬细胞成为高表达PD-L1和IL-10的M2样巨噬细胞,并通过PD-L1/PD-1和IL-10抑制T细胞的活化及其抗肿瘤作用。但是,TRAP是否能够调节中性粒细胞功能并在肿瘤免疫中发挥相应的免疫调节作用,有待进一步研究。目的:探讨肿瘤细胞释放自噬小体(TRAP)是否调节中性粒细胞的细胞生物学行为,研究TRAP诱导中性粒细胞凋亡的分子机制,初步探讨吞噬TRAP的中性粒细胞是否对T细胞和肿瘤细胞具有调节作用及其机制。方法:1.肿瘤细胞释放自噬小体(TRAP)调节中性粒细胞的细胞生物学行为的研究人外周血中性粒细胞,与不同浓度CFSE标记的TRAP共孵育3 h;或与3μg/mL CFSE标记的TRAP共孵育不同时间;或与3μg/mL CFSE标记的TRAP在4℃和37℃孵育3 h,流式细胞术检测中性粒细胞吞噬CFSE标记TRAP的比例。人外周血中性粒细胞,与不同浓度TRAP共孵育6 h;或与3μg/mL TRAP共孵育不同时间;或与3μg/mL的肺癌、卵巢癌和乳腺癌病人瘤性胸/腹水TRAP共孵育6 h,流式细胞术检测中性粒细胞凋亡比例。2.中性粒细胞摄取TRAP及其诱发细胞凋亡的分子机制研究人外周血中性粒细胞,分别与CD(10μg/mL)、CPZ(4μg/mL)、Filipin III(12μg/mL)和EIPA(20μM)预处理30 min,再与3μg/mL CFSE标记的TRAP共孵育3 h,流式细胞术检测中性粒细胞吞噬CFSE标记TRAP的比例;或分别与CD(10μg/mL)、CPZ(4μg/mL)、Filipin III(12μg/mL)和EIPA(20μM)预处理30 min,再与10μg/mL的TRAP共孵育6 h,流式细胞术检测中性粒细胞凋亡比例。人外周血中性粒细胞,与不同浓度TRAP共孵育30 min;或分别与DPI(20μM)和NAC(7.5 mM)预处理30 min,再与10μg/mL的TRAP共孵育30 min,流式细胞术检测中性粒细胞内ROS含量;或分别与DPI(20μM)和NAC(7.5 mM)预处理30 min,再与10μg/mL的TRAP共孵育6 h,流式细胞术检测中性粒细胞凋亡比例。人外周血中性粒细胞,分别与CD(10μg/mL),EIPA(20μM)和DPI(20μM)预处理30min,再与10μg/mL的TRAP共孵育24 h,检测中性粒细胞caspase-3活性;或与zVAD-fmk(50μM)预处理30 min,再与10μg/mL的TRAP共孵育6 h,流式细胞术检测中性粒细胞凋亡比例。3.吞噬TRAP的中性粒细胞对T细胞和肿瘤细胞的调节作用及其机制的初步探讨3.1吞噬TRAP的中性粒细胞对T细胞的免疫调节作用及其机制人外周血中性粒细胞,与不同浓度TRAP共孵育30 min,收获细胞,再与CFSE标记的PBMC共培养6天,流式细胞术检测CD4~+和CD8~+T细胞增殖情况。或与30μg/mL的TRAP在37℃共孵育30 min,收获细胞,再与PBMC共培养3天,流式细胞术检测IFN-γ~+T细胞比例,ELISA检测共培养上清中IFN-γ含量;流式细胞术检测CD4~+和CD8~+T细胞表面CD69和CD137以及PD1和CTLA4表达情况。分离人外周血中性粒细胞,与NAC(7.5 mM)预处理30 min,再与30μg/mL的TRAP共孵育30 min,收获细胞,并与CFSE标记的PBMC共培养6天;或与CFSE标记的PBMC用Transwell小室分开共培养6天,流式细胞术检测CD4~+和CD8~+T细胞增殖情况。3.2吞噬TRAP的中性粒细胞对肿瘤细胞生物学效应的调节作用及其机制3.2.1吞噬TRAP的人中性粒细胞对肿瘤细胞生物学效应的调节作用及其机制人外周血中性粒细胞,与10μg/mL TRAP共孵育12 h,收获中性粒细胞培养上清,用所获上清培养MDA-MB-231细胞,观察MDA-MB-231细胞迁移、划痕愈合与侵袭情况。或与3μg/mL TRAP共孵育6 h,qRT-PCR检测TRAP诱导中性粒细胞后CCL2和MMP9等分子的变化。或与10μg/mL TRAP共孵育12 h,明胶酶谱实验检测TRAP诱导的中性粒细胞上清中MMP9酶活性。或在所获上清中分别加入MMP9封闭抗体及同型对照抗体,再培养MDA-MB-231细胞,观察MDA-MB-231细胞迁移与侵袭情况。3.2.2吞噬TRAP的小鼠中性粒细胞对肿瘤细胞生物学效应的调节作用小鼠中性粒细胞,与3μg/mL CFSE标记的TRAP共孵育3 h,流式细胞术检测小鼠中性粒细胞吞噬CFSE标记TRAP的比例。或与3μg/mL的TRAP共孵育6 h,流式细胞术检测小鼠中性粒细胞凋亡比例。或与10μg/mL TRAP共孵育12 h,收获小鼠中性粒细胞培养上清,用所获上清培养Hepa1-6细胞,观察Hepa1-6细胞迁移与侵袭情况。采用B16F10细胞尾静脉输注小鼠,构建肺转移肿瘤模型,同时分别尾静脉输注PBS,Neutrophil(培养基对照)和Neutrophil(TRAP处理),两天后再次尾静脉输注PBS,Neutrophil(培养基对照)和Neutrophil(TRAP处理),接种第21天收获各组小鼠的肺脏,观察肿瘤结节数量及大小。结果:1.肿瘤细胞释放自噬小体(TRAP)调节中性粒细胞的细胞生物学行为的研究中性粒细胞能够快速大量地吞噬TRAP,TRAP可诱导中性粒细胞凋亡。与DNase I和RNase A处理的TRAP相比,Proteinase K处理的TRAP诱导中性粒细胞凋亡的比例明显减少。与膜结构完整的TRAP相比,膜破碎的TRAP不能诱导中性粒细胞凋亡。2.中性粒细胞摄取TRAP及其诱发细胞凋亡的分子机制研究与CPZ和Filipin III预处理组相比,CD预处理组中性粒细胞吞噬TRAP的比例明显减少,同时中性粒细胞凋亡的比例也明显减少。与未处理组相比,EIPA预处理组中性粒细胞吞噬TRAP的比例明显减少,同时中性粒细胞凋亡的比例也明显减少。不同浓度的TRAP处理中性粒细胞后,ROS表达增加;用DPI或还原剂NAC预处理中性粒细胞后,TRAP诱导中性粒细胞产生的ROS含量明显减少,同时TRAP诱导中性粒细胞凋亡的比例也明显减少。与未处理组相比,CD、EIPA或DPI预处理中性粒细胞组caspase-3活性明显减弱;用caspase家族抑制剂zVAD-fmk预处理中性粒细胞后,TRAP诱导中性粒细胞凋亡的比例明显减少。3.吞噬TRAP的中性粒细胞对T细胞和肿瘤细胞的调节作用及其机制的初步探讨3.1吞噬TRAP的中性粒细胞对T细胞的免疫调节作用及其机制抗人CD3抗体联合抗人CD28抗体可以诱导CD4~+和CD8~+T细胞增殖,加入吞噬TRAP的中性粒细胞后CD4~+和CD8~+T细胞增殖比例减少,且随着TRAP浓度增加,CD4~+和CD8~+T细胞增殖比例逐渐减少,而加入未处理的中性粒细胞未影响CD4~+和CD8~+T细胞的增殖。与未处理的中性粒细胞组相比,吞噬TRAP的中性粒细胞组IFN-γ~+T细胞的数量减少,同时共培养上清中IFN-γ含量也减少。与未处理的中性粒细胞相比,吞噬TRAP的中性粒细胞减少CD4~+和CD8~+T细胞表面CD69和CTLA4的表达,对CD137和PD1的表达无影响。与吞噬TRAP的中性粒细胞组相比,NAC预处理的吞噬TRAP的中性粒细胞组CD4~+和CD8~+T细胞增殖比例有所增加。进一步采用Transwell小室培养方法将吞噬TRAP的中性粒细胞和PBMC隔开,结果发现,与混合培养组相比,Transwell隔开培养组CD4~+和CD8~+T细胞增殖比例明显增加。3.2吞噬TRAP的中性粒细胞对肿瘤细胞生物学效应的调节作用及其机制3.2.1吞噬TRAP的人中性粒细胞对肿瘤细胞生物学效应的调节作用及其机制与培养基对照组和未处理中性粒细胞上清组相比,吞噬TRAP的中性粒细胞上清组MDA-MB-231细胞迁移数量增加,划痕愈合增快,侵袭数量增加。TRAP诱导中性粒细胞后,中性粒细胞中CCL2、MMP9和TNF-α的mRNA表达明显增加;明胶酶谱实验发现TRAP诱导中性粒细胞上清中MMP9酶活性明显增加。与加了同型对照抗体的上清组相比,加了MMP9封闭抗体的吞噬TRAP的中性粒细胞上清组MDA-MB-231细胞迁移和侵袭数量减少。3.2.2吞噬TRAP的小鼠中性粒细胞对肿瘤细胞生物学效应的调节作用小鼠中性粒细胞能够吞噬TRAP,TRAP可以诱导小鼠中性粒细胞凋亡。与培养基对照组和未处理小鼠中性粒细胞上清组相比,吞噬TRAP的小鼠中性粒细胞上清组Hepa1-6细胞迁移和侵袭数量增加。与PBS对照组和未处理小鼠中性粒细胞组相比,吞噬TRAP的小鼠中性粒细胞组肺脏中B16F10肿瘤结节数量增多,体积增大。结论:1.人中性粒细胞通过大胞饮方式,高效、快速吞噬TRAP,并定位于溶酶体;2.TRAP通过触发中性粒细胞产生ROS并诱导caspase-3活化,进而在体内、体外促进中性粒细胞凋亡;3.吞噬TRAP的中性粒细胞依赖ROS和细胞直接接触方式抑制T细胞增殖和IFN-γ产生;4.吞噬TRAP的中性粒细胞通过MMP9促进乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移与侵袭;5.吞噬TRAP的小鼠中性粒细胞促进肝癌Hepa1-6细胞迁移与侵袭,并促进黑色素瘤B16F10细胞体内肺转移及生长。
【学位单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R730.3
【部分图文】：
采用同样的检测手段，我们证实了肿瘤病人瘤性胸/腹水中含有 LC3 II 阳性的自噬小体（图 1-1 D-E）。图1-1 MDA-MB-231细胞上清和瘤性胸/腹水中募集到的自噬小体鉴定（A）流式细胞术检测 MDA-MB-231 细胞上清募集到的沉淀表面 LC3 的表达（；B）Western blot检测 MDA-MB-231 细胞募集到的沉淀以及细胞裂解液中 LC3 I 和 LC3 II 的表达；（C） 透射电子显微镜检测募集到的沉淀的生物学形态；（D） 流式细胞术检测肿瘤病人瘤性胸/腹水中募集到的沉淀表面 LC3 的表达；（E） Western blot 检测 MDA-MB-231 细胞裂解液和瘤性胸/腹水中募集到的沉淀中 LC3 I 和 LC3 II 的表达；（F） 透射电子显微镜检测瘤性胸/腹水中募集到的沉淀的生物学形态。
第一章 肿瘤细胞释放自噬小体（TRAP）调节中性粒细胞的细胞生物学行为的研究2.获取纯化的人外周血中性粒细胞为了获得实验所需的纯化的人外周血中性粒细胞，我们采用Ficoll分离液Histopaque1.077 和 Histopaque 1.119 对人外周血进行密度梯度离心，分别采用瑞氏染色法和流式细胞术检测手段鉴定人外周血中性粒细胞纯度。瑞氏染色法结果显示，与分离前白细胞相比，分离后所获细胞几乎多为含杆状核和分叶核的中性粒细胞，淋巴细胞少见（图 1-2 A）。流式细胞术进一步观察发现：98%的细胞表达中性粒细胞特异性表面标志 CD66b（图 1-2B）。提示：密度梯度离心法获得的人外周血中性粒细胞纯度好，可以满足后续实验所需。
共孵育 30 min，流式细胞术检测发现，随着 TRAP 浓度增加，中性粒细胞凋亡比例增加（图 1-5）。提示：TRAP 在体内也能诱导中性粒细胞凋亡。图1-5 TRAP体内诱导小鼠腹腔中性粒细胞凋亡检测1 mL1%糖原/生理盐水溶液腹腔诱导 Balb/c 小鼠中性粒细胞，糖原刺激 4 h 后，腹腔再注入 2 mL含不同浓度 TRAP（0，10，30 和 100 μg/mL）的生理盐水溶液，流式细胞术检测 TRAP 诱导小鼠腹腔中性粒细胞凋亡比例。我们又收取临床肺癌、卵巢癌和乳腺癌肿瘤病人的瘤性胸/腹水，提取临床病人的自噬小体，再与中性粒细胞共孵育。流式细胞术检测发现，吞噬临床病人来源的 TRAP后
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本文编号：
2853794
