RNF125通过泛素化修饰PD-L1促进肿瘤免疫的分子机制研究

发布时间：2020-10-26 10:55

　　 目的 以PD-1/PD-L1抗体为代表的肿瘤免疫治疗有效提高了黑色素瘤、非小细胞肺癌和肝癌等多种肿瘤患者的预后。研究表明PD-1/PD-L1抗体的有效性与肿瘤细胞表面PD-L1的表达密切相关。本研究的目的是构建PD-L1的重组真核表达载体,研究RNF125与PD-L1相互作用及这种相互作用对PD-L1的表达的影响,并进一步研究RNF125调控PD-L1的分子机制。方法 1、通过重组PCR方法,将PD-L1的cDNA插入到pCMV-Myc-Vector和pCMV-HA-Vector中,构建pCMV-Myc-PD-L1和pCMV-HA-PD-L1重组真核表达载体。2、通过免疫印迹及免疫共沉淀方法,研究RNF125与PD-L1的相互作用及这种相互作用对PD-L1蛋白表达量的影响。3、通过RT-PCR及免疫印迹方法,研究在IFN-γ刺激下RNF125对人肝癌HepG2细胞中PD-L1表达的调控作用。4、通过泛素化实验,研究RNF125调控PD-L1发生泛素化的结构域及泛素化的形式。结果 1、将酶切后的目的基因与空载体连接起来,再经转化、涂板、挑单克隆后进行RCR鉴定,琼脂糖凝胶电泳显示在750bp~1000bp的位置可见目的条带。选取插入目的基因的细菌克隆菌液进行测序,结果显示阳性菌液的测序结果与NCBI数据库中人PD-L1基因序列完全一致。将重组质粒转化到293T细胞中,通过免疫蛋白印迹在35Kd的位置可见到目的条带,表明PD-L1的重组真核表达载体构建成功。2、将Flag-RNF125与Myc-PD-L1共转染至293T细胞中,通过免疫共沉淀,发现Flag-RNF125可与Myc-PD-L1发生相互作用,将浓度依次增加的Myc-RNF125与HA-PD-L1共转染至293T细胞中,通过免疫印迹实验,发现Myc-RNF125可以下调HA-PD-L1的表达,并呈剂量依赖性,表明RNF125可与PD-L1相互作用并下调PD-L1的表达。3、通过过表达或RNAi技术,上调或下调人肝癌HepG2细胞中RNF125的表达,采用RT-PCR和免疫印实验,与对照组相比,过表达RNF125可以促进HepG2细胞中IFN-γ引起的PD-L1的表达水平下调,而敲低RNF125可以促进HepG2细胞中IFN-γ引起的PD-L1的表达水平上调,表明RNF125可能通过调控PD-L1参与肝癌肿瘤免疫。4、将RNF125(WT或C72,75A)、Ub(WT,K48only或K63only)、PD-L1共转染至293T细胞中,通过泛素化实验发现RNF125可以使PD-L1发生K48位连接形式的泛素化修饰,而Ring结构域突变的RNF125则不影响PD-L1的泛素化水平,表明RNF125通过K48位形式的泛素化修饰PD-L1从而参与肿瘤免疫。结论 本研究成功构建了PD-L1的重组真核表达载体,并发现RNF125可以与PD-L1发生相互作用降低PD-L1蛋白的稳定性;进一步研究发现,RNF125能够使PD-L1发生K48连接形式的泛素化,而RNF125泛素化酶活性缺失突变体则丧失了这样的功能。
【学位单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R730.51
【部分图文】：

可以通过调控免疫检查点分子参与肿瘤免疫逃逸。用肿瘤微环境人为地增强或正常化机体的免疫功能、抑现阶段临床肿瘤免疫治疗方案的主要机制。目前研究较方案包括溶瘤病毒疫苗、细胞过继免疫治疗（CAR-T，C查点阻断剂（CTLA-4，PD-1/PD-L1抗体）等[6-8]。其中嵌疫疗法(CAR-T)细胞在治疗血液肿瘤的临床试验得实质4抗体作为第一个上市的免疫检查点阻断剂也有效的提高的预后，而PD-1和PD-L1抗体因在黑色素瘤、非小细胞肺胱癌和霍奇金淋巴瘤等15余种肿瘤的治疗中均取得了实的受到关注[9]。目前抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体已成为肿热点。

-L1 促进肿瘤免疫的分子机制研究 别信号，是 TCR（T 细胞受体）与抗原要组织相容性复合体）的特异性结合；C 表达的协同刺激分子（如 CD28/B7）和及 TIM-3 等）与 T 细胞表面的相应受体续时间。正常组织中，PD-L1 和 PD-1维持自身免疫耐受，防止自身免疫性用过表达的 PD-L1 分子抑制 T 细胞的

介导靶蛋白通过蛋白酶体途径降解，而K63连接的泛素化修饰则通常参与信号转导途径，包括DNA损伤修复和蛋白激酶的激活等，为蛋白的相互作用提供分子平台（图3）。图3：泛素化修饰示意图RNF125，又称为TRAC-1 (T cell RING protein identified in activationscreen)。人类的RNF125基因定位于18号染色体，其cDNA全长699bp，所编码的蛋白具有232个氨基酸，在骨髓、脾脏、胸腺、淋巴组织中大量存在[20]。RNF125属于RING结构域家族的泛素E3连接酶，包括五个结构域，即N端的RING结构域，C端的三个串联的锌指样结构域（一个C2HC结构域，两个C2H2结构域）以及一个泛素结合基序UIM (Ubiquitin interacting motif)[21](图4)
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本文编号：2856903