PSMB4在肝细胞肝癌中的表达及其对肝癌细胞增殖和凋亡的影响研究

发布时间：2020-10-26 13:35

　　 目的1、观察人蛋白酶体β亚基4型(PSMB4)在肝细胞肝癌(简称肝癌,HCC)患者组织中的表达情况,探讨PSMB4在肝癌患者癌组织中的表达水平与各临床参数之间的关系及其作为肝癌预后标记物和治疗靶点的意义。2、利用特异性短发夹RNA(shRNA)技术构建干扰PSMB4表达的肝癌细胞,并进一步阐明PSMB4对肝癌细胞增殖、凋亡能力的影响。方法1、组织水平,通过TCGA数据库分析PSMB4在肝癌组织中的表达情况,然后利用蛋白质免疫印迹检测8例肝癌患者癌及癌旁组织样本中PSMB4蛋白表达的差异;应用免疫组织化学法对105例肝癌患者的癌组织及25例正常肝组织进行检测,以进一步分析PSMB4蛋白在肝癌中的表达情况,并结合临床病理资料分析其表达情况与患者性别、年龄、血清AFP水平、肝硬化、肿瘤数量、HBV感染、最大肿瘤直径、肿瘤转移、微血管侵犯、肿瘤分化程度、TNM分期等因素之间的关系;应用Cox风险回归模型进行单因素及多因素分析影响肝癌患者生存的危险因素,然后通过TCGA数据库及Kaplan-Meier法分析PSMB4的表达水平与肝癌患者生存之间的关系。2、细胞水平,利用蛋白质免疫印迹检测正常肝细胞系(L02)和三种肝癌细胞系(HepG2、SMMC7721、LM3)中PSMB4的基础表达情况。然后设计PSMB4基因特异性shRNA质粒并转染入SMMC7721细胞,转染成功后检测PSMB4干扰效率,并运用平板克隆实验、MTT实验及流式细胞仪检测转染组和对照组细胞的增殖及凋亡情况。结果1、TCGA数据库显示PSMB4基因在肝癌mRNA水平的表达显著高于正常肝组织(P0.05)。蛋白质免疫印迹结果显示,7例肝癌患者的癌组织中PSMB4蛋白表达水平显著高于对应的癌旁组织(P0.05),另外1例患者的表达差异不明显。免疫组化染色结果显示在105例肝癌组织中PSMB4高表达57例(54.3%),低表达48例(45.7%),而在25例正常肝组织中多为低表达或不表达(68%)。肝癌组织中PSMB4高表达与HBV感染、肿瘤最大直径、肿瘤分化程度、TNM分期有关(P0.05)。单因素和多因素分析表明肝癌患者5年生存情况与肿瘤大小、肿瘤转移、分化程度、TNM分期、PSMB4表达水平有关,其中肿瘤转移和PSMB4高表达是肝癌患者的独立危险因素(P0.05)。TCGA数据库与Kaplan-Meier生存曲线分析均表明PSMB4高表达的患者比PSMB4低表达患者生存时间短(P0.05)。2、PSMB4在肝癌HepG2细胞和SMMC7721细胞中表达显著高于正常肝L02细胞。另外,本研究成功构建干扰PSMB4表达的SMMC7721实验组细胞,干扰效率明显。平板克隆实验、MTT实验和流式细胞仪检测结果表明干扰PSMB4表达后的SMMC7721细胞增殖能力减弱,凋亡能力增强(P0.05)。结论1、PSMB4在肝癌组织中的表达高于癌旁肝组织,其表达水平与HBV感染、肿瘤大小、组织学分级及TNM分期有关。2、PSMB4高表达是肝癌患者独立的差的预后因素,因此PSMB4可作为肝癌预后的潜在标志及治疗的潜在靶点。3、干扰PSMB4表达可以抑制肝癌细胞增殖、促进其凋亡。
【学位单位】：南通大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.7
【部分图文】：

南通大学硕士学位论文 第三章 结 果第三章 结 果3.1 肝癌组织及癌旁肝组织中 PSMB4 的表达情况首先，我们利用 TCGA 数据库对 PSMB4 在肝癌 mRNA 水平的表达进行了分析，结果显示 PSMB4 在肝癌组织的表达显著高于正常肝组织（P<0.05, 图 1）。随后，我们对随机选取的 8 例肝癌患者新鲜组织样本，运用 western blot 检测对应的癌及癌旁组织中 PSMB4 蛋白的表达情况，GAPDH 为内参得到标化的PSMB4 蛋白表达量。结果显示，在 7 例样本中肝癌组织的 PSMB4 蛋白表达水平明显高于癌旁组织（P<0.05），另 1 例样本表达无差异（P>0.05），如图 2 所示。

图 2 肝癌组织中 PSMB4 蛋白的表达情况A. Westernblot 检测 PSMB4 在 8 例随机选取的配对样本中的蛋白表达水平（T，tumor，肝癌组织；N，normal，癌旁肝组织）；B. PSMB4/GAPDH 灰度分析结果（*P<0.05）。3.2 肝癌组织样本中 PSMB4 的免疫组化染色结果为了进一步研究 PSMB4 在肝癌组织中的表达，我们对纳入研究的 105 例肝癌患者的癌组织及 25 例正常肝组织进行石蜡包埋，制作病理组织切片，然后进行 PSMB4 免疫组织化学染色分析。观察 PSMB4 在肝癌组织及正常肝组织切片上的染色情况，结果发现 PSMB4 染色主要分布于细胞浆和细胞核内，染色呈棕色及棕黄色颗粒样（图 3）。在纳入研究的 105 例肝癌组织中，57 例（54.29%）显示为 PSMB4 高表达，余下的 48 例（45.71%）显示为 PSMB4 低表达，而在25 例正常肝组织中 8 例（32%）显示为 PSMB4 高表达，17 例（68%）显示为PSMB4 低表达或者不表达，表达差异具有统计学意义（χ2=4.0114, P<0.05）（表5）。

17图 3 肝癌及癌旁组织的 PSMB4 免疫组化染色结果A. 低分化肝癌组织强阳性染色 (+++)；B. 中分化肝癌组织中阳性染色的 (++)； C. 高分化肝癌组织弱阳性染色的 (+)；D. 正常肝组织阴性表达 (－)（×200）。3.3 肝癌组织中 PSMB4 的表达水平与各种临床病理参数的关系为了进一步明确 PSMB4 的表达在肝癌发生发展中的作用，我们通过 χ2 检验分析了 PSMB4 的表达水平和肝癌患者临床病理因素之间的相关性。根据PSMB4 的表达情况，将肝癌标本分为两个组，PSMB4 高表达组（总评分大于 3分）和 PSMB4 低表达组（总评分小于等于 3 分）。结果显示，PSMB4 的表达水平与 HBV 感染、肿瘤最大直径、肿瘤分化程度、TNM 分期有关（P<0.05）；而与其他临床病理的因素，如年龄、性别、血清 AFP 水平、肝硬化、肿瘤数目、肿瘤转移和微血管侵犯没有相关性（P>0.05，表 6）。
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本文编号：2857068