miR-378对泌尿生殖系肿瘤发生发展的作用机制初探

发布时间：2020-10-26 18:48

　　 目的:探讨microRNA-378(miR-378)对肾癌细胞体外增殖和迁移能力的影响及其可能的作用机制并探讨miR-378对前列腺癌细胞体外增殖能力及对成骨前体细胞分化的影响。方法:在肾癌的相关研究中(第一部分),使用TCGA数据库分析肾癌和正常肾上皮组织中miR-378的表达情况并使用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法在人肾癌细胞系及人肾小管上皮细胞系(HK2)中验证miR-378的表达情况。人工合成miR-378 mimic和inhibitor并转染肾癌细胞系。使用CCK8法检测miR-378对肾癌细胞增殖的影响,通过Transwell实验和划痕愈合实验检测miR-378对肾癌细胞迁移的影响,通过生物信息学分析筛选肾癌细胞中miR-378可能的靶基因并通过qRT-PCR及蛋白免疫印迹(western blot)方法验证。在前列腺癌的相关研究中(第二部分),通过扫描电镜观察及粒径分布仪检测分析不同来源外泌体的形态和纯度。人工合成miR-378 mimic并分别转染前列腺癌细胞系LNCaP细胞和小鼠成骨前体细胞系MC3T3-E1细胞。通过qRT-PCR检测比较前列腺癌细胞系LNCaP细胞和前列腺良性增生细胞系BPH1细胞培养上清来源的外泌体中miR-378的表达差异。使用CCK8法检测miR-378并同时抑制外泌体的释放对LNCaP细胞增殖的影响。通过生物信息学分析并通过qRT-PCR、免疫荧光染色验证LNCaP细胞及MC3T3-E1细胞中过表达miR-378并抑制外泌体释放后miR-378相应靶基因的表达变化。结果:在肾癌的相关研究中(第一部分)我们发现miR-378在肾癌组织和肾癌细胞系中表达显著上调(P0.001);过表达miR-378在体外促进肾癌细胞的增殖(P0.01)及迁移能力(P0.001)。本研究首次在肾癌中筛选并鉴定了miR-378的靶基因大型肿瘤抑制因子2(large tumor suppressor 2,LATS2),qRT-PCR和western blot实验进一步验证了该基因表达与miR-378的表达呈负相关。在前列腺癌的相关研究中(第二部分),qRT-PCR实验表明,与BPH1细胞比较,LNCaP细胞体外培养上清来源的外泌体中miR-378表达量显著升高(P0.01)。在LNCaP细胞中过表达miR-378并同时抑制外泌体释放在体外可抑制前列腺癌细胞的增殖(P0.01)。在MC3T3-E1细胞中过表达miR-378并抑制外泌体释放显著上调成骨前体细胞分化标志物osteocalcin、OSX的表达。本研究首次在前列腺癌细胞中筛选并鉴定了miR-378的靶基因MAOA,在MC3T3-E1细胞中筛选并鉴定了miR-378的靶基因Gli3和Schnurri3,通过qRT-PCR验证了靶基因的表达与miR-378的表达呈负相关。在LNCaP和MC3T3-E1细胞中分别过表达miR-378并抑制外泌体释放可抑制MAOA及Gli3和Schnurri3的表达(P0.01)。结论:肾癌的相关研究中(第一部分)表明,在体外过表达miR-378可通过抑制LATS2表达增强人肾癌细胞的增殖和迁移。前列腺癌的相关研究中(第二部分)表明,体外过表达miR-378可通过抑制MAOA表达而抑制前列腺癌细胞的增殖,可通过抑制Gli3和Schnurri3表达促进成骨前体细胞的分化。
【学位单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737
【部分图文】：

图 1-1 miR-378 在肾癌临床样本和肾癌细胞系中的显著高表达。 A:肾癌组织和正常肾上皮组织的 miR-378 的相对表达情况。NC：正常肾上皮组织对照。B：癌组织高表达和低表达 miR-378 的肾癌病人的总体生存情况。C：qRT-PCR 检测肾癌细胞系和肾小管上皮细胞系中 miR-378 的相对表达情况。Figure 1-1 miR-378 is significantly overexpressed in renal Carcinoma tissues and cell lines.A: The relative expression level of miR-378 in renal Carcinoma tissues（n=379） and normal renaltissues(n=36). NC: normal control *P<0.05. B: Kaplan-Meier analysis of the overall survival ofpatients with renal carcinoma with high and low levels of miR-378 expression. *** P<0.001. C: Therelative expression level of miR-378 in renal Carcinoma cell lines and in renal proximal tubularepithelial cell line (HK2) detected by qRT-PCR. *** P<0.001.3.2 过表达或者敲低 miR-378 对肾癌细胞增殖的影响为了研究 miR-378 对细胞增殖的影响，我们首先将 miR-378mimic 转染 786-O和 Caki-1 细胞，利用 CCK-8 方法分析细胞增殖能力的变化。如图 2A 显示，过表

图 1-2: miR-378 可显著促进 786-O 和 Caki-1 细胞的增殖。 A：CCK8 实验表明 miR-378表达可明显促进786-O和Caki-1 细胞的增殖。B: 敲降miR-378则明显抑制786-O和Caki-1胞的增殖Figure 1-2: miR-378 promoted the proliferation of 786-O and Caki-1 cells. A：miR-378verexpression significantly promoted the growth of both 786-O and Caki-1 cells. B: miR-378nockdown significantly inhibited the growth of both 786-O and Caki-1 cells, as demonstrated byCK-8 proliferation assay..3 过表达或者敲低 miR-378 对肾癌细胞迁移的影响我们选取低表达 miR-378 的肾癌细胞系 786-O 过表达 miR-378,选择高表达iR-378 的肾癌细胞系 Caki-1 进行敲降 miR-378，利用 Transwell 小室检测 miR-378肾癌细胞迁移能力的影响。结果显示，过表达 miR-378 后 786-O 细胞的迁移能显著增加（P＜0.001）（图 3A）。敲降 miR-378 后 Caki-1 细胞的迁移能力显著减

图 1-3：miR-378 对肾癌细胞迁移的影响。 A：过表达 miR-378 可以显著增加 786-O 细胞的迁移能力。B：敲降 miR-378 可以显著降低 Caki-1 细胞的迁移能力。Figure1-3: The effect of miR-378 on the migration of renal cancer cells. A: miR-378overexpression significantly promoted the migration of 786-O cells. B: miR-378 knockdownsignificantly inhibited the migration of Caki-1 cells. Migrated cells were counted under a 100×microscope field. Scale Bar: ***P<0.001.3.4 过表达或者敲低 miR-378 对肾癌细胞迁移的影响分别在 786-O 细胞中过表达 miR-378、在 Caki-1 细胞中敲降 miR-378 后，利用划痕愈合实验检测 miR-378 对肾癌细胞迁移的影响。如图 4A 显示，过表达miR-378 促进 786-O 细胞的迁移。敲降 miR-378 抑制 Caki-1 细胞的迁移。
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本文编号：2857380