转录调节因子NUPR1在乳腺癌细胞三苯氧胺耐药性中的功能及机制研究

发布时间：2020-10-27 02:26

　　 目的:乳腺癌的耐药性是临床复发和转移致死的主要原因,近年来的报道认为乳腺癌耐药性与细胞自噬密切相关,但其详细的分子机制不甚清楚。转录调节因子NUPR1(亦称为nuclear protein 1,p8或Com 1)在肿瘤中的生物学功能引起了研究人员们的广泛关注,但关于NUPR1在乳腺癌细胞耐药性方面的功能还未见报道。本课题的研究目的是深入探究耐受三苯氧胺的乳腺癌细胞中NUPR1的生物学功能,阐明转录调节因子NUPR1如何通过调控细胞自噬途径介导三苯氧胺耐药性的分子机制,并在临床样品中验证;同时探讨基于NUPR1生物学效应而进行的改善乳腺癌细胞耐药性的可行性,即NUPR1潜在的临床应用价值。此项研究结果将有助于了解乳腺癌中细胞自噬调控途径,丰富人们对产生乳腺癌耐药性的分子机制认识。方法:本项研究由三部分组成。第一部分,NUPR1在乳腺癌患者中的表达情况及乳腺癌细胞在产生耐药性过程中的自噬水平变化。利用免疫组织化学染色检测评估133例乳腺癌患者的组织样本中NUPR1的表达量以及分布变化,进一步统计分析组织芯片中NUPR1与患者生存期的关系。通过RT-PCR与Western blot的实验手段检测人正常乳腺上皮细胞系MCF-10A与多种乳腺癌细胞系及其相应的已产生耐药性的多种乳腺癌细胞系中NUPR1的表达水平。Western blot检测自噬标志蛋白SQSTM1、LC3B的表达量变化,揭示自噬流的动态变化水平,并利用自噬抑制剂bafilomycin A1(BafA1)和chloroquine(CQ)干预自噬途径,通过BrdU细胞增殖实验检测细胞增殖变化。第二部分:NUPR1在介导乳腺癌细胞产生耐药性过程中的生物学功能。利用shRNA在耐药性的乳腺癌细胞系MCF-7、T47D中下调NUPR1后,使用光学显微镜和透射电子显微镜分别观察细胞的形态学变化和细胞的超微结构。稳定表达mCherry-GFP-LC3质粒以及Lyso-Tracker Red和mono dansylcadaverine(MDC)染色检测自噬流量的变化。通过Western blot检测自噬相关途径标志蛋白的表达水平差异,随后进行流式细胞仪细胞周期检测实验、BrdU细胞增殖实验、细胞克隆形成能力实验、细胞侵袭能力实验、β-gal检测细胞衰亡标记分子变化实验和雌性裸鼠乳腺注射成瘤的体内实验等检测下调NUPR1后耐药性细胞发生的一系列生物学功能改变。第三部分:NUPR1干预自噬途径产生耐药性的机制。首先通过免疫沉淀、质谱鉴定分析NUPR1在维持细胞耐药性中的复合物,即相互作用的蛋白。其次将未处理的、三苯氧胺处理后耐药性的、以及产生耐药性后再下调NUPR1的乳腺癌细胞系MCF7提取总RNA,进行转录组测序,随后比较转录组基因表达差异。通过ChIP-re-ChIP,Luciferase和EMSA实验等验证NUPR1直接调控的下游基因。结果:第一部分研究结果显示:人乳腺癌组织芯片的免疫组织化学染色结果显示NUPR1在人乳腺癌组织中较癌旁组织高表达,且主要富集在细胞核中;高表达NUPR1的乳腺癌患者具有较短的生存期(P0.005)。进一步分析得知NUPR1的表达与临床分期和年龄密切相关(P0.005)。蛋白质免疫印迹实验检测结果显示,NUPR1在细胞中表达量随着药物处理时间的延长不断升高,且已产生耐药性的细胞持续高表达NUPR1。同时,处理过程中自噬标记分子的表达变化揭示着耐药性细胞整体的自噬流量上升。BrdU细胞增殖实验表明干扰自噬流量显著影响了耐药性细胞的增殖水平。第二部分研究结果显示:下调NUPR1后,细胞出现变大变扁平的形态,并随时间的推移逐渐死亡,β-gal检测显示是通过细胞衰亡途径死亡的;Lyso-Tracker Red染色为阳性,揭示着细胞内为酸性环境;综合mCherry-GFP-LC3实验和Western blot检测自噬标志蛋白结果表明自噬溶酶体的降解途径受阻;透射电子显微镜观察发现细胞出现大量的溶酶体以及自噬溶酶体。NUPR1下调后的细胞恶性程度在体内外实验中显著下降,表现为细胞增殖能力、侵袭能力和克隆形成能力下降,小鼠体内成瘤率和肿瘤体积均显著小于对照组。第三部分研究结果显示:分析未处理的、三苯氧胺处理后耐药性的、以及产生耐药性后再下调NUPR1的乳腺癌细胞系MCF7的转录组测序结果后,发现溶酶体、细胞周期和雌激素等信号途径中的诸多基因转录水平改变,例如BECN1、LCN2、RAB31和NEDD9等。利用ChIP-re-ChIP实验验证NUPR1、ESR1在BECN1基因启动子区上明显富集。Luciferase实验结果显示,下调NUPR1后促进BENC1基因的转录活性,去除ESR1的结合位点后,削弱了对BECN1的抑制性作用。进一步EMSA体外实验结果表明,NUPR1可以与BECN1基因的启动子区域结合。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.9
【部分图文】：

天津医科大学博士学位论文 一、NUPR1 在乳腺癌的表达及耐药性产生过程中的自噬变化性（P > 0.05）。采用 Kaplan-Meier 方法绘制患者的总生存曲线图，同时用 LogRank 检验分析得出如图 1.1 E 所示结果，NUPR1 的表达水平与乳腺癌患者的生存预后密切相关，低表达 NUPR1 的乳腺癌患者具有较长的生存期，提示着NUPR1 可作为不良预后的检测。

27图 1.2.2 三苯氧胺耐药性产生过程中乳腺癌细胞的自噬变化。A, 蛋白质免疫印迹实验检测 0.4μM 三苯氧胺处理的细胞中 LC3B 和 SQSTM1 的蛋白表达变化,ACTB 蛋白为对照。B, 蛋白质免疫印迹实验检测 ATG5、ATG7 在细胞中被下调表达的效率，同时检测下调 ATG5、ATG7 后，细胞中 LC3B 和 SQSTM1 的表达水平。C,BrdU 细胞增殖实验检测在母代细胞和耐药性细胞中下调 ATG5、ATG7后细胞的增殖变化水平。D, 在母代细胞和耐药性细胞中加入自噬抑制剂 BafA1或 CQ 处理细胞 10 小时后，Westernblotting 实验检测 LC3B 和 SQSTM1 的表达量变化。E,BrdU 细胞增殖实验检测在母代细胞和耐药性细胞中加入自噬抑制剂BafA1 或 CQ 处理细胞 10 小时后的细胞增殖水平差异。

文 二、NUPR1 在介导乳腺癌细胞耐药性中的生物学功能45图2.2.1 下调NUPR1 后导致自噬溶酶体的降解途径受阻。A，蛋白质免疫印迹实验检测三条NUPR1shRNA 的敲低效率，ACTB 蛋白作为对照。B，在各个细胞系中，检测NUPR1、LC3B 和SQSTM1 的蛋白水平变化，以ACTB 为参考值。C, MCF-7、MCF-7TamR shRNA con 和 NUPR1 shRNA 细胞的透射电子显微镜图。（注：箭头所指为细胞中的溶酶体和自噬溶酶体结构；N 代表细胞核；M 指示线粒体）D，Lyso-Tracker Red 和 MDC 染色结果的荧光图，比例尺 10 μm。Western blot 检测 LC3B 和SQSTM1 的蛋白量变化，ACTB 蛋白为对照（下图）。E
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本文编号：2857885