黑豆皮花青素对肝癌细胞的作用及分子机理研究
发布时间：2020-10-27 06:29
在我国肝癌是一种高致死率的恶性疾病,它的预防与治疗一直是解决的重点与难点。从自然界中寻找出一种天然无毒副作用的抗肿瘤药物成了关注的热点。本课题组前期研究了从黑豆皮中提取、分离与纯化花青素成分的不同方法与最佳条件。但黑豆皮中花青素(Black soybean coats anthocyanins,BSCA)所含成分类型,及相关性质与作用机制还需深入探讨。为了进一步探究黑豆皮中花青素(BSCA)的抗氧化性能与其抑制肝癌的分子机制,本文主要通过以下内容展开:1.通过高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法对BSCA进行检测分析,并与多种标品出峰时间比较得出所提BSCA的主要成分有四种,分别是飞燕草素葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矮牵牛素葡萄糖苷和矢车菊素。将不同浓度的BSCA作用于细胞,检测细胞内抗氧化酶指标、MDA指标以及ROS变化。结果发现BSCA促使SOD、CAT、GSH-Px等指标升高,而降低了MDA及ROS的水平,表明BSCA具有良好抗氧化性能。2.采用MTT和EDU法进行细胞增殖实验检测,筛选经BSCA处理后抑制效果最明显的细胞株,结果显示BSCA抑制肝癌Hep G2细胞的效果最为显著,且呈相应的时间-剂量相关性。用不同浓度的BSCA分别作用于细胞,观察细胞形态与细胞核的变化情况。结果表明,激光共聚焦显微镜观察发现经BSCA作用后,细胞形态发生了明显皱缩,间隙增大,数量减少;细胞核发生皱缩,成月牙状。流式细胞术检测发现BSCA作用细胞后,引起了线粒体膜电位的降低。3.用不同浓度的BSCA处理Hep G2细胞与SMMC7721细胞后,使用Western Blot技术和qRT-PCR对JAK2/STAT3信号通路中的JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3的蛋白水平以及基因水平的表达情况加以检测,同时使用Western Blot方法检测了凋亡途径中相关蛋白PARP、Caspase-3、Bcl-2、Bax、p53、p63等的表达情况。结果表明p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2、Caspase-3的表达量均随作用浓度及时间的增加而降低,p53、p63的表达量逐渐升高。由此得出,BSCA能促进凋亡相关蛋白的表达而抗凋亡相关蛋白的表达受到了一定程度的抑制。另外,对JAK2采取shRNA干扰后,JAK2蛋白的表达明显下调,再将BSCA作用于shJAK2细胞株后,结果显示出BSCA对shJAK2细胞中JAK2表达的抑制效果更为明显。由此得出BSCA可通过抑制JAK2/STAT3信号通路致使肝癌Hep G2、SMMC7721细胞发生凋亡。上述结果为研发天然无毒副作用的抗肿瘤药物提供了理论依据,也为抗癌的靶向治疗研究提供了新的思路。
【学位单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.7
【部分图文】：
图 1.1 JAK2/STAT3 信号通路途径Fig 1.1 JAK2/STAT3 signaling pathway1.2.2 JAK2/STAT3 信号通路与细胞凋亡JAK2（蛋白酪氨酸激酶 2）/STAT3（信号转导和转录激活因子）信号途种人类癌细胞的生存、增殖与代谢方面显露出特别关键的效能[26-28]。JAK2 是子受体信号传输的重要信号因子[29]，若其收到刺激而活化后，JAK2 激酶就STAT3，STAT3 级联的下游目标也被激活，发挥各自特有的功效，受 STAT3之基因皆和促癌生长、扩散、转移等高度相关，如 BcL-2、Cyclin D1、c-Myc等，超常活性的 STAT3 可引发这些下游的目标基因过度表达，促使癌细胞的展[30-32]。STAT3 又为磷酸化的 JAK2 首选之下游靶基因，并在多种肿瘤细胞中活，保持活跃态，拥有原癌基因潜能，即致癌作用，以及抗凋亡活性[33,34]。于断 STAT3 上游之激活因子 JAK2 或制止 STAT3 本身发生磷酸化成为了一种潜效抗癌策略。据了解，已研发多种 JAK2 的抑制剂，其中 AG490 是首个 JA制剂。通过抑制 JAK2 的活性和诱导凋亡，选择性地抑制癌细胞的体内外生
黑豆皮花青素对肝癌细胞的作用及分子机理研究.4 结果与分析.4.1 BSCA 成分分析与鉴定前期已通过探究得知最佳提取方法及相关提取优化条件。本研究将用 D101脂纯化后的 BSCA 进行 HPLC 分析其所含成分及含量，并与标准品参照比对出黑豆皮中花青素所含成分分别是（1）飞燕草素葡萄糖苷（D3G）占 6.7%、车菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G）占 64%、（3）矮牵牛素葡萄糖苷（Pt3G）占 34）矢车菊素（Cy）占 20.5%。结果如 Fig. 2.1 所示。其中所含主要的花青素 C3G，含量为 10.02 mg/g。
14图 2.3 黑豆皮花青素对细胞内活性氧的影响Fig. 2.3 Effects of anthocyanins from black soybean coats on ROS in Hep G2 cells andSMMC7721 cells. （A、B）The level of ROS was detected and analyzed by Flow cytometry inhepatoma cells.Cells were treated with 150 μg/mL BSCA for indicated times ,upon each experimentalgroup stained with DCFH-DA, and analyzed by Flow cytometry.（C）The line graph showed the ROSlevels over time.2.4.5 讨论本章首先采用 HPLC 技术检测鉴定了来源于山西的 BSCA 的组分，分别为矢车菊素 3-O-葡萄糖苷（C3G）、飞燕草素葡萄糖苷（D3G）、矮牵牛素葡萄糖苷（Pt3G）和矢车菊素（Cy）四种成分组成，其中主要成分为 C3G，含量为 10.02 mg/g。刘占
【参考文献】
本文编号：2858184
【学位单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.7
【部分图文】：
图 1.1 JAK2/STAT3 信号通路途径Fig 1.1 JAK2/STAT3 signaling pathway1.2.2 JAK2/STAT3 信号通路与细胞凋亡JAK2（蛋白酪氨酸激酶 2）/STAT3（信号转导和转录激活因子）信号途种人类癌细胞的生存、增殖与代谢方面显露出特别关键的效能[26-28]。JAK2 是子受体信号传输的重要信号因子[29]，若其收到刺激而活化后，JAK2 激酶就STAT3，STAT3 级联的下游目标也被激活，发挥各自特有的功效，受 STAT3之基因皆和促癌生长、扩散、转移等高度相关，如 BcL-2、Cyclin D1、c-Myc等，超常活性的 STAT3 可引发这些下游的目标基因过度表达，促使癌细胞的展[30-32]。STAT3 又为磷酸化的 JAK2 首选之下游靶基因，并在多种肿瘤细胞中活，保持活跃态，拥有原癌基因潜能，即致癌作用，以及抗凋亡活性[33,34]。于断 STAT3 上游之激活因子 JAK2 或制止 STAT3 本身发生磷酸化成为了一种潜效抗癌策略。据了解，已研发多种 JAK2 的抑制剂，其中 AG490 是首个 JA制剂。通过抑制 JAK2 的活性和诱导凋亡，选择性地抑制癌细胞的体内外生
黑豆皮花青素对肝癌细胞的作用及分子机理研究.4 结果与分析.4.1 BSCA 成分分析与鉴定前期已通过探究得知最佳提取方法及相关提取优化条件。本研究将用 D101脂纯化后的 BSCA 进行 HPLC 分析其所含成分及含量，并与标准品参照比对出黑豆皮中花青素所含成分分别是（1）飞燕草素葡萄糖苷（D3G）占 6.7%、车菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G）占 64%、（3）矮牵牛素葡萄糖苷（Pt3G）占 34）矢车菊素（Cy）占 20.5%。结果如 Fig. 2.1 所示。其中所含主要的花青素 C3G，含量为 10.02 mg/g。
14图 2.3 黑豆皮花青素对细胞内活性氧的影响Fig. 2.3 Effects of anthocyanins from black soybean coats on ROS in Hep G2 cells andSMMC7721 cells. （A、B）The level of ROS was detected and analyzed by Flow cytometry inhepatoma cells.Cells were treated with 150 μg/mL BSCA for indicated times ,upon each experimentalgroup stained with DCFH-DA, and analyzed by Flow cytometry.（C）The line graph showed the ROSlevels over time.2.4.5 讨论本章首先采用 HPLC 技术检测鉴定了来源于山西的 BSCA 的组分，分别为矢车菊素 3-O-葡萄糖苷（C3G）、飞燕草素葡萄糖苷（D3G）、矮牵牛素葡萄糖苷（Pt3G）和矢车菊素（Cy）四种成分组成，其中主要成分为 C3G，含量为 10.02 mg/g。刘占
【参考文献】
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本文编号：2858184
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